非对称垂直流场流分级技术应用于病毒样颗粒稳定性的研究
发布时间：2020-08-10 07:29
【摘要】：病毒样颗粒(virus-like particle)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白,但不包含核酸的自组装颗粒,其形态与真正病毒粒子相同或相似,可作为疫苗的抗原成分。乙肝表面抗原(HBsAg)是一种重要的病毒样颗粒,可以通过注射来使机体产生抗体,达到免疫和阻断乙肝传播的目的。在HBsAg的生产和流通过程中,需要面对许多苛刻的环境因素,比如盐浓度、温度变化,反复冻融等,这些环境因素可能会导致HBsAg出现聚集失活现象,从而影响了疫苗的安全性和有效性。但遗憾的是,目前尚无系统的乙肝疫苗稳定性研究报道。在本文中,我们首次采用无填充介质的非对称垂直流场流分级技术偶联多角度激光散射技术(AF4-MALLS)应用于乙肝疫苗病毒样颗粒的表征,并对两种常见的乙肝疫苗产品(分别由中国仓鼠卵CHO细胞和汉逊酵母细胞表达)在其纯化、生产、运输以及储存过程中所经历的不同环境条件下的颗粒稳定性进行了研究,主要内容包括：1)优化得到了适于分离HBsAg及其聚集体的场流分级条件：①进样和聚焦阶段：进样流速0.2 ml/min,聚焦流速1.8 ml/min,外场流速1.0 ml/min,时间4 min,聚焦阶段和分级阶段的过渡时间是1 min,腔室出口流速保持1.0 ml/min恒定；②分级阶段：外场流速1.0 ml/min保持40 min,然后在5 min内线性衰减到0；③再生阶段：腔室流速1ml/min,保持5min。间隔物厚度350 μm,分离膜为再生纤维素膜,截留分子量为10 kDa。采用AF4-MALLS表征得到中国仓鼠卵CHO细胞表达的CHO-HBsAg和汉逊酵母细胞表达的Hans-HBsAg的重均分子量分别为4742 kDa和3039 kDa；水力学半径分别为29.4 nm和22.8nm。2)通过AF4-MALLS对CHO-HBsAg和Hans-HBsAg在不同溶液环境下的聚集行为进行了研究,并使用抗原诊断试剂盒检测了相应的抗原活性。在2M硫酸铵条件下,CHO-HBsAg比较稳定,活性保持在95%,而Hans-HBsAg明显发生聚集形成分子量105-106 kDa的聚集体,其活性仅保留25%；在反复冻融操作之后,CHO-HBsAg的结构和活性几乎没有什么变化,而Hans-HBsAg发生了明显的聚集,活性仅剩余26.9%：在高温(60℃)处理之后,CHO-HBsAg依然稳定,而Hans-HBsAg的活性已经不足5%。3)系统考察了氯化钠和硫酸铵对Hans-HBsAg稳定性的影响,并对Hans-HBsAg在盐溶液中的聚集行为进行了分析,在此基础上建立了Hans-HBsAg在盐溶液中的聚集模型。Hans-HBsAg在NaCl溶液中发生可逆聚集形成寡聚体(OP),伴随着生物活性的轻微损失。通过透析除去NaCl之后,寡聚体可重新解聚为正常组装体,同时抗原活性随之恢复。在硫酸铵溶液中的聚集情况较为复杂,当硫酸铵浓度较低(0.5M)且作用时间较短时(1h),大部分HBsAg聚集成寡聚体形式,当硫酸铵去除后,寡聚体可以重新解聚;而高浓度硫酸铵条件下,OP会进一步聚集形成高聚体(PP), PP的尺寸很大,且该聚集过程会导致抗原活性大幅度降低。即使通过透析去除硫酸铵,也无法使得PP重新解聚成正常组装体,抗原活性也无法恢复。4)考察了几种常见的小分子添加剂对Hans-HBsAg稳定性以及抗原活性的影响。脲和盐酸胍对乙肝疫苗聚集没有明显抑制作用,相反它们作为变性剂,可使蛋白发生聚集；精氨酸对乙肝聚集方面发挥了比较明显的抑制作用,精氨酸对乙肝疫苗聚集的抑制效果与其浓度相关,当精氨酸浓度达到1M时,抑制效果较好；聚乙二醇对乙肝疫苗的抗原活性似乎没有明显影响。而表面活性剂对乙肝疫苗抗原活性的影响表现出不同的效果,吐温80可以提高乙肝疫苗的活性,而Triton100则会使乙肝疫苗的活性降低。
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392;TQ464
【图文】：
３０逦非对称垂直流场流分级技术应用于病毒样颗巧稳定性的研巧与调节功能。不同的生物膜胆固醇的含量在２５％到５０％么间。胆固醇在踞脂双逡逑层上的最大溶解度为６６％，超过此浓度将导致胆固醇变成晶体状。鉴于胆固醇逡逑的重要作用，大多数在体外的生物膜模拟研究时都会包含胆固醇。当脂质分散逡逑于水性溶液中时，由于分子具有极性导致聚集的发生，疏水链包在内侧，亲水逡逑的极性头指向外侧。聚集的形式取决于分子结构、浓度Ｗ及周围溶液环境诸如逡逑温度、离子强度＾＾义溶剂姐成等等。典型的－种是脂质小巧泡，俗称脂质体，逡逑通常是大小O喗缍ǖ模植荚冢玻埃玻埃板澹睿矸段冢治∏膳荨⒋笄膳荩准板义铣笕荩惴河τ糜诜治隽煊颉６嗖阆迮菘赏ü煌姆椒ㄖ魄傻ゲ闱膳荩义喜煌姆椒ɑ岬贾滦纬刹煌牡ゲ阈∨荩绯苫竦眯∏膳荩费雇义匣竦么竽荩ㄍ迹保保担ｅ义希恚颍睿蝈澹睿妫
本文编号：2787770
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392;TQ464
【图文】：
３０逦非对称垂直流场流分级技术应用于病毒样颗巧稳定性的研巧与调节功能。不同的生物膜胆固醇的含量在２５％到５０％么间。胆固醇在踞脂双逡逑层上的最大溶解度为６６％，超过此浓度将导致胆固醇变成晶体状。鉴于胆固醇逡逑的重要作用，大多数在体外的生物膜模拟研究时都会包含胆固醇。当脂质分散逡逑于水性溶液中时，由于分子具有极性导致聚集的发生，疏水链包在内侧，亲水逡逑的极性头指向外侧。聚集的形式取决于分子结构、浓度Ｗ及周围溶液环境诸如逡逑温度、离子强度＾＾义溶剂姐成等等。典型的－种是脂质小巧泡，俗称脂质体，逡逑通常是大小O喗缍ǖ模植荚冢玻埃玻埃板澹睿矸段冢治∏膳荨⒋笄膳荩准板义铣笕荩惴河τ糜诜治隽煊颉６嗖阆迮菘赏ü煌姆椒ㄖ魄傻ゲ闱膳荩义喜煌姆椒ɑ岬贾滦纬刹煌牡ゲ阈∨荩绯苫竦眯∏膳荩费雇义匣竦么竽荩ㄍ迹保保担ｅ义希恚颍睿蝈澹睿妫
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