高通量人乳头瘤病毒及人类免疫缺陷病毒假病毒检测体系的建立及应用

发布时间：2020-08-10 14:38

【摘要】：假病毒检测技术在病毒疫苗评价及抗病毒药物研究中应用广泛，其中最具代表性的是HPV及HIV的假病毒检测技术，但现有技术还存在许多缺陷，特别是检测通量较低，难以应用于大规模的疫苗临床评价和血清流行病学调查，而且对于HIV耐药分析中的弱势株检出率较低。本研究基于上述问题，建立了两种高通量的HPV假病毒检测技术和一种HIV假病毒检测技术，并在中和抗体及耐药性检测方面进行了应用。通过报告基因筛选及引入新的结果判读技术，建立了两种高通量HPV中和抗体评价方法，并对影响检测的各种因素进行了优化和验证。利用建立的方法检测50份疫苗免疫血清样本，发现HPV疫苗免疫产生的高滴度中和抗体对亲缘关系较近型别的病毒具有一定的交叉保护作用；在对HPV自然感染人群样本检测中发现，相同亚属病毒的中和抗体有共同出现的趋势，出现该趋势的原因不是抗体的交叉保护，而是不同型别病毒先后感染相同个体引起的。中和抗体检测结果与细胞学检测HSIL+之间无明显的相关性。通过HIV-1骨架载体改造，提高了假病毒构建效率和耐药性检测效率。在耐药性样本检测中，发现了与蛋白酶抑制剂NFV相关的两个耐药性突变位点K20R和I72M，与核苷类逆转录酶抑制剂AZT相关的两个耐药性位点T69I和F130S。在b12中和抗体表位分析中，发现了病毒膜蛋白上三个影响中和抗体b12敏感性的氨基酸位点，分别为V2区的V182L，C2区的N276S，C3区的R346S。本研究中建立的三种方法，极大地提高了检测通量，能基本满足现有的检测需求，在HPV临床样本检测、HIV耐药性分析及HIV中和抗体表位分析等方面具有较好的应用前景。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.11
【图文】：

高通量,假病毒,检测体系,自然感染

图 1.1 高通量 HPV 假病毒检Figure 1.1 Establishment and application ofplatform 2. 高通量 HIV 假病毒检测体系的随着 HAART 疗法的普遍应用，耐药的上升的趋势，耐药 HIV 病毒株的出现也是新耐药位点的出现和多位点联合耐药病药性检测技术的应用都提出了很大的挑耐药性检测方法，对于新出现的耐药位点的高通量包括两个方面，一是病毒构建的疫人群样本检测自然感染人群样本

发光检测,质粒,载体,基因

Gluc载体、Fluc基因、Seap基因及Nanoluc基因（引物见表2.1），用in技术分别将载体与Fluc、Seap、Nanoluc扩增片段连接，转化大肠杆菌后进行序列测定，将序列比对无误的质粒连同pCMV-Gluc2质粒进行大提取。A B C D

假病毒,报告基因,滴度

将上述四种报告基因质粒的浓度统一调至1 μg/μl，与HPV16 L1/L2表达质粒共转染真核细胞293FT，制备包装有不同报告基因的HPV16假病毒。将上述四种假病毒分别系列稀释后接种293FT细胞，培养72小时后，分别加入对应的检测底物，检测不同稀释度对应的化学发光值RLU（relative light unit），以稀释倍数的对数值作横坐标，以化学发光值的对数值作纵坐标，绘制散点图并做线性回归，Seap、Gluc和Nanoluc假病毒对应的线性相关系数R2都在0.99以上（图 2.1）。同时，以不同报告基因假病毒稀释1600倍的RLU值和未加假病毒的细胞对照的RLU值做柱状图（图 2.2.），发现未加假病毒的细胞对照（即实验检测本底）Seap >Fluc >Gluc >Nanoluc，相同稀释度下病毒检测值与细胞对照的比值可以反映假病毒的滴度，四种假病毒滴度依次为Nanoluc >Gluc >Seap >Fluc，根据线性相关系数、实验检测本底以及病毒滴度的结果，初步选定Nanoluc和Gluc作为候选报告基因进行进一步研究。

【参考文献】