巴马小型猪糖尿病心肌病模型的建立及鉴定

发布时间：2020-08-11 21:32

【摘要】：目的:探讨静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立巴马小型猪糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)模型,确定最佳造模方法,研究构建巴马小型猪糖尿病心肌病模型的代谢特点及心肌病理组织学变化,为今后糖尿病心肌病更广泛领域的研究提供合适的动物模型。方法:实验一:巴马小型猪DCM最佳造模方法的确立及鉴定:选取4-5月龄、体质量为19-25kg的健康雄性广西巴马小型猪12头,一日三次普通饲料喂养,随机分为两组:正常对照组(n=6只);DCM模型组(n=6只)。DCM模型组空腹12 h后,一次性耳缘静脉注射STZ 150mg/kg。观察两组小型猪一般状况,记录造模前及造模后体重变化及空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)水平。造模前、造模后6月末及10月末,前腔静脉抽血测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酐(creatinine,Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)浓度,造模后6月选取正常对照组及DCM模型组各一头,行胰腺及心肌组织进行HE染色、胰岛β细胞免疫组化染色,造模后10月末全部处死取材,取两组小型猪心肌组织进行HE及MASSON染色。实验二:巴马小型猪DCM可复制性及特征研究:选取4-5月龄的健康雄性广西巴马小型猪10头,随机分为2组:正常对照组(n=5),DCM模型组(n=5)。DCM模型组空腹12 h后,按照实验一的造模方法进行造模。测定并记录两组小型猪造模前基本情况及生化指标,造模后10月末两组小型猪前腔静脉抽血后全部处死取材,检测记录生化指标,应用试剂盒检测小型猪血清氧化应激指标:丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Orgotein Superoxide Dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase,GSH-PX);Western blot法检测小型猪心肌组织NF-KB p65、BcL-2、Bax、TGFβ1表达。造模后10月末两组小型猪心肌取材后行电镜检测。结果:实验一:(1)DCM模型组小型猪均成模,表现出典型的“三多一少”的症状,无死亡及感染。(2)自造模后3天开始,与对照组比较,DCM模型组FPG水平明显升高并一直维持在较高状态(P(27)0.01);(3)小型猪造模后6月末及10月末,正常对照组体重持续增长,而DCM模型组小型猪体重涨幅并不明显,与DCM模型组比较有差异(P(27)0.01)。(4)STZ造模后6月末,两组小型猪ALT、AST、BUN、Cr水平比较无统计学意义(P0.05),STZ造模后10月末,与正常对照组比较,DCM模型组AST、BUN、Cr水平明显升高(P0.05,P0.01)。(5)造模后6月末,两组小型猪胰腺及心肌组织HE染色镜下结果显示:DCM模型组可见胰岛细胞明显减少、胰岛细胞分布紊乱、萎缩,空泡变性等病理表现。胰岛β细胞免疫组化染色结果显示:DCM模型组可见散在数个胰岛细胞团,细胞排列紊乱。心肌组织HE染色结果示:肌纤维排列整齐,分布比较均匀。(6)造模后10月末取心肌组织行HE染色结果显示:DCM模型组小型猪心肌细胞存在不同程度的变性(如空泡变性,水变性等)、坏死及凋亡,局部可见炎症细胞浸润。MASSON染色结果显示:心肌细胞出现水肿、体积变大、肿胀,溶解等现象,纤维化较严重,整体结构极其紊乱,不规则。实验二:(1)DCM模型组4只成模,1只死亡;(2)造模后10月末,与正常对照组小型猪相比,DCM模型组小型猪FPG及ALT水平明显升高(P0.05,P0.01);(3)试剂盒检测血清氧化应激指标结果提示:与正常对照组比较,DCM模型组小型猪MDA含量明显升高,SOD和GSH-PX活性明显下降(P0.01);(4)与正常对照组比较,DCM模型组心肌组织NFKB p65、BAX、TGFβ1蛋白表达水平明显升高,BCL-2蛋白表达水平明显降低(P0.05,P0.01)。(5)造模后10月末取心肌组织电镜结果显示:心肌组织可见肌原纤维排列较紊乱、肌原纤维间隙线粒体数量明显减少,心肌组织可见大量空泡变性线粒体。结论:采用大剂量STZ(150mg/kg)一次性耳缘静脉注射10月后可以成功构建巴马小型猪DCM模型,模型重复性及稳定性好,DCM模型组小型猪存在明显糖代谢紊乱及氧化损伤,且DCM模型组心肌组织存在炎症反应、心肌细胞凋亡和纤维化表现。
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R542.2;R-332
【图文】：

小型猪,空腹血糖

ure 1 Comparison of body weight between two groups of miniature pig（ x s）（(Note: compared with the control group, P<0.01)两组小型猪空腹血糖（FPG）比较STZ 造模后第三天开始，与正常对照组比较，DCM 模型组小型猪的显升高（P 0.01），详见图 2。

小型猪,生化指标,胰岛

图 3 两组小型猪生化指标比较（x s）（注：与对照组比较， P<0.01， P<0.05）Figure3 Comparison of biochemical indicators of two groups of miniature pig(Note: compared with the control group, P<0.01， P<0.05)2.5 两组小型猪 6 月末胰腺组织 HE 染色结果造模后 6 个月末，选正常对照组及 DCM 模型组各 1 只小型猪禁食 12 小时后行胰腺组织 HE 染色，模型组镜下胰岛形态萎缩，边缘不规整，细胞排列紊乱，胰岛及胰岛内细胞数目减少、细胞核形状不规则（图 4B）。

小型猪,生化指标,血清,氧化应激

图 8 两组小型猪生化指标比较（x s）（注：与对照组比较， P<0.01， P<0.05）gure 8 Comparison of biochemical indicators between two groups of small pigs（x s）(Note: compared with the control group, P<0.01， P<0.05)两组小型猪 10 月末血清 MDA、SOD、GSH-PX 指标比较试剂盒检测血清氧化应激指标：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、型谷胱甘肽(GSH-PX)。结果提示：与正常对照组比较，DCM 模型组 MD明显升高，SOD 和 GSH-PX 活性明显下降（P＜0.01），详见图 9。

【参考文献】