甲型和乙型流感病毒的型特异性启动子序列影响型间病毒复制机制的研究

发布时间：2020-08-13 10:39

【摘要】：甲型和乙型流感病毒是威胁人类健康的主要病原体,其基因组结构及编码的蛋白都非常相似。甲型和乙型流感病毒分别能够在型内或谱系间发生重配,但不能发生型间重配。甲型和乙型流感病毒的启动子序列高度保守,但它们在核苷酸构成上存在明显差异,这些差异元素的生物学意义尚不清楚。因此,本研究拟从甲型和乙型流感病毒启动子的差异元素入手,探索它们在型间病毒复制中的生物学意义。本研究中,我们分别对甲型和乙型流感病毒各基因片段的启动子序列进行了大规模的生物信息学分析,全面展示了甲型和乙型流感病毒启动子区的序列特征,发现了型特异性启动子元素的存在,分别为甲型流感病毒vRNA启动子中的5U、6'A和乙型流感病毒vRNA启动子中的5C、6'U。我们建立了甲型(A/WSN)和乙型(B/Yam)流感病毒的小型复制子系统,并比较了甲型和乙型流感病毒聚合酶对同型和异型vRNA模板的偏好性,结果表明,在小型复制子系统中,甲型和乙型流感病毒聚合酶都更偏好同型模板。随后,我们利用该系统,深入地研究了型特异性启动子元素互换对甲型和乙型流感病毒RNA合成和蛋白表达的影响,通过这些实验,我们首次发现型特异性启动子元素——vRNA启动子3'端第5个核苷酸是关键的启动子元素,它能够特异性地识别甲型和乙型流感病毒聚合酶。另外,我们通过体内、体外聚合酶活性试验,深入地探索了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3'端第5个核苷酸的特性在调节体内、体外聚合酶活性中的作用,结果表明,甲型和乙型流感病毒型特异性的启动子元素——vRNA启动子3'端第5个核苷酸的特性直接决定了聚合酶活性,它能够在RNA合成的起始和延伸的多个环节起作用。随后,我们利用反向遗传学技术,研究了这些启动子元素突变对病毒复制的影响。我们在病毒感染水平上确认了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3'端第5个核苷酸是调节型特异性的关键位点。有趣的是,甲型和乙型流感病毒对型特异性启动子元素互换突变的表现不同,其中在甲型流感病毒A/WSN中,将甲型特异性U5替代为乙型特异性C5,传代2-3次后,该位点能迅速地发生回复突变,而在乙型流感病毒B/Yam中,将乙型特异性C5替代为甲型特异性U5,经连续传代后,仍然能够保留该突变,但明显降低了病毒的复制效率。这些结果强调了甲型和乙型流感病毒对核苷酸突变的容忍度及其聚合酶的纠错能力存在明显差异。总之,本研究首次发现并揭示了甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素3'端第5个核苷酸是决定型特异性的关键位点。这表明甲型和乙型流感病毒启动子的变化会引起核糖核蛋白复合物的不匹配,对进一步阐明甲型和乙型流感病毒不能发生型间重配的机制具有重要的指导意义,也丰富了我们对流感病毒型特异性以及启动子生物学意义的认识。本课题还揭示了甲型和乙型流感病毒聚合酶在转录机制上存在的细微差异,这些功能差异将为甲型和乙型流感病毒聚合酶结构的研究提供重要素材。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373.13
【图文】：

示意图,甲型流感病毒,乙型流感病毒

逑？邋ＨＡ邋0ＮＡ邋｜｜邋Ｍ２邋0邋ＮＥｆ＞邋？Ｍ１逦零邋ＨＡ邋ｆＮＡ邋ｆＢＭ２邋：邋ＮＢ邋０邋ＮＥ（＞邋？Ｍ１逡逑图１－１甲型流感病毒（Ａ图）和乙型流感病毒（Ｂ图）结构示意图１１５１逡逑１．１．２流感病毒的生命周期逡逑流感病毒的生命周期主要包含下列几个方面：吸附和进入到宿主细胞，ｖＲＮＰ逡逑进入宿主细胞核，流感病毒基因组的转录和复制，ｖＲＮＰ出核和病毒的组装和释放逡逑（图邋１－２）。逡逑＃ＩＦＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄ逦ｆ邋＇逡逑；邋ａｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ逡逑丁邋》ｙ逦Ｆｔｅｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｏＪ逡逑／逦ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ逡逑＊．逦Ｉ逦Ｐａｃｋｉｎｇ逡逑ｙ逦Ｉ逡逑ＥｎｄｏｃｙｔｏｓｌｓＪ逦Ｃｆ＊Ｓｌ＞邋邋逦ＴｒａｎｓＵｔｉｏｎ邋■逡逑，邋一邋＼逦ｔ逡逑Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ逡逑ｍＲＮＡ邋＼逡逑（＋）ｃＲＮＡ？＝＝＝ａ逡逑＼逦Ｆｕｓｉｏｎ邋ａｎｄ逦Ｎｕｃｌｅｕｓ邋，逡逑、＇逦ｕｎｃｏａｔｉｎｇ逡逑图１－２甲型流感病毒的生命周期示意图１１６１逡逑１．吸附到宿主细胞逡逑流感病毒从ＨＡ与宿主细胞膜上的唾液酸受体的结合开始其生命周期ｍ0ＨＡ为逡逑Ｉ型糖蛋白，以同源三聚体（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）形式存在，它被包埋于病毒脂质囊膜表面逡逑的纤突［１］。ＨＡ０是ＨＡ的前体，ＨＡ１和ＨＡ２两个亚基系ＨＡ０裂解生成，受体结合逡逑结构域位于ＨＡ１上，是一种跨膜结构域，它可以插入到病毒囊膜的表面，融合肽逡逑位于ＨＡ２上

启动子,流感病毒,结构模型,环结构

ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ水平，研宄证实了真实的ｃＲＮＡ启动子也采取ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ逡逑结构模型，而且发现３＇端的四核苷酸环上的第４、５、７碱基和２－９碱基对（ｂａｓｅ邋ｐａｉｒ）逡逑对于ｃＲＮＡ启动子活性非常重要（图１－４）。另外，通过体外聚合酶结合实验（／／？邋ｖ／ｒｒｏ逡逑ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ａｓｓａｙ）进一步确定了邋ｃＲＮＡ启动子５＇端发卡环结构的存在，但仍逡逑无直接证据表明３’端发卡环结构的存在，其具体功能尚不知晓。逡逑１４逡逑

启动子,甲型流感病毒

动子ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ结构模型［６｜］。该模型的主要特征为３＇和５＇端的保守序列能够形成两逡逑个短发卡环（ｈａｉｒｐｉｎ邋ｌｏｏｐ）结构，每个发卡环都含有一个２个核苷酸长度的莲部和逡逑一个四核苷酸环（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ），它们通过碱基配对的ｄｕｐｌｅｘ区域（图１－４方框标注处）逡逑连接起来（图１－４）。体外实验表明５＇端的发卡环结构为体外转录（ＡｐＧ－ｐｒｉｍｅｄ逡逑ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）邋｜５ｔ）］和ｍＲＮＡ的多聚腺苷酸化１６２１所必需，而３＇和５＇端的发卡环同时存逡逑在不仅是维持内切酶活性所必需的［５６，５８］，而且对于维持聚合酶的稳定性也有一定作逡逑用［５９］。另外，有研究认为当加帽的ＲＮＡ底物含有ＣＡ裂解位点（ＣＡｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ），逡逑即能够产生含有以ＣＡ为末端含有帽子结构的引物时，ｖＲＮＡ的３＇端只作为ｍＲＮＡ逡逑合成的模板，无须发卡环结构［６３］。逡逑１．１．５核糖核蛋白复合物（ＲＮＰ）的功能逡逑流感病毒生命周期中作用极其重要的成分是核糖核蛋白复合物（ＲＮＰ）邋１６４１邋（图逡逑１－５）。ＲＮＰ使流感病毒的基因组衣壳化，它是流感病毒基因组进行转录逡逑（ｖＲＮＡ—ｍＲＮＡ）和复制（ｖＲＮＡ＾ｃＲＮＡ）的最小功能单元。病毒吸附至ＩＪ宿主细逡逑胞，发生低ＰＨ诱导的内吞之后，病毒中的ＲＮＰ释放到宿主细胞胞浆中。在宿主细逡逑胞转运机制的作用下

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