交链孢霉B细胞表位疫苗免疫治疗改善小鼠哮喘气道炎症的研究

发布时间：2020-08-14 06:55

【摘要】：背景:交链孢霉是与过敏性疾病相关的最常见霉菌之一。空气中高水平的交链孢霉暴露量是哮喘发作的重要危险因素,儿童早期对交链孢霉过敏也是哮喘的独立危险因素。过敏原免疫治疗仍然是治疗过敏性疾病的唯一疾病对因疗法。高质量的过敏原疫苗是免疫治疗取得疗效的最重要的因素之一,然而目前临床上应用的交链孢霉提取物大多来源于天然过敏原,其成分复杂,直接影响了免疫治疗的疗效和安全性。另外,由于不同的培养环境、品种差异、提纯工艺、检验流程都存在巨大差异,使得过敏原提取物很难实现统一的标准化生产。目的:我们的目的是使用噬菌体展示肽模拟交链孢霉B细胞表位,合成模拟表位疫苗,并评价交链孢霉B细胞表位模拟肽疫苗对Balb/c小鼠哮喘模型气道炎症的治疗作用。方法:1.运用噬菌体展示肽技术,首先使用健康人血清库孵育噬菌体库三次,筛去噬菌体库中与交链孢霉特异性IgE非特异性结合的部分,然后再与交链孢霉过敏病人血清池孵育三次,筛选可以特异性结合交链孢霉特异性IgE高变区的B细胞模拟表位。2.将上述模拟表位经过扩增孵育后进行DNA测序并与交链孢霉组分三维结构匹配,筛选出匹配性高的交链孢霉模拟表位合成模拟肽疫苗。得到的疫苗再与交链孢霉过敏患者血清中特异性IgE进行结合实验和抑制实验以及与交链孢霉患者嗜碱性粒细胞进行活化抑制实验验证其可靠性。3.建立小鼠哮喘模型,将六周龄Balb/c雌性小鼠随机分为空白对照组、模型组、无关噬菌体对照治疗组、交链孢霉提取物治疗组和模拟肽疫苗治疗组共5组,每组6只。小鼠在第4、5、6天用交链孢霉提取物滴鼻致敏,空白组给予0.9%生理盐水。在第18、19、20天用交链孢霉提取物激发,第36、37、38天再次激发,空白组用0.9%生理盐水。第21、22天,取血验证模拟肽疫苗与哮喘小鼠血清IgE的结合力。在第23、24、25、26天,用0.9%生理盐水、无关噬菌体对照、交链孢霉提取物和模拟肽疫苗对相应小鼠进行皮下注射。老鼠在最后一次激发后48小时内处死。结果:1.相对于模型组和无关噬菌体对照组小鼠的症状如毛发杂乱,焦躁不安或过于安静,抓鼻,流鼻涕,点头呼吸,呼吸加快等,模拟肽疫苗治疗组小鼠症状明显改善。2.相比于模型组和无关噬菌体对照组小鼠,模拟肽疫苗治疗组小鼠BALF炎性细胞组数和嗜酸性粒细胞数降低。3.模拟肽疫苗治疗组小鼠相对于模型组和无关噬菌体对照组小鼠,血清总IgE和特异性IgE降低,总IgG1和特异性IgG1升高。4.模拟肽疫苗治疗组小鼠相对于模型组和无关噬菌体对照组小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ升高,IL-4降低。5.相对于模型组和无关噬菌体对照组小鼠,模拟肽疫苗治疗组小鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2细胞比例增加。6.模拟肽疫苗治疗组肺泡与支气管炎性细胞浸润明显减少、气道狭窄好转。结论:结果表明,交链孢霉B细胞模拟肽疫苗能改善小鼠哮喘模型的过敏性炎症反应,并可能作为IgE介导的交链孢霉过敏性疾病潜在的新型治疗药物。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R-332;R562.25
【图文】：

中 科 技 大 学 博 士 学 噬菌体展示肽技术筛选交链孢用噬菌体展示肽技术筛选并初步确定模拟肽示模拟肽筛选特异性多肽的生物技术。它是的外壳基因中而又不破坏基因编码蛋白的能示在噬菌体的外壳蛋白中。当嵌入的 DNA 片会组成一个肽库，这种多肽是以噬菌体为载可以被巨量的噬菌体中的特定噬菌体所识别的氨基酸序列得到这种多肽。[40-45]（图 1）为核苷酸序列，外周为蛋白质外壳。

14图 2. 噬菌体肽库淘选流程验材料要材料菌体随机七肽库试剂盒（Phage Display Peptide Library，Ph.D.-7）购自 d Bioland Biolabs 公司；搜集自华中科技大学同济医学院附属同济医院过敏反应科门诊 2015 年 1 12 月就诊的交链孢霉过敏患者的血清，患者初次检测皮肤点刺结果阳oCAP-250 检测为交链孢霉特异性 IgE 阳性，最终选取 30 例未接受治疗的

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文纸巾上拍去残留液体，一共洗板五次。2.3.6 将微孔板清洗干净后加入 100μl 的 BSA（1 mg/ml）+甘氨酸-HCl (pH 2.2)来分离噬菌体：室温摇床 15 分钟左右，加入 Tris-HCl（pH 9.1）15μl 来中和洗脱液，这就是我们的目标噬菌体洗脱液。2.3.7 上述步骤重复三次。（图 3）

本文编号：2792672