布氏锥虫BBP1蛋白定位及功能分析

发布时间：2020-08-14 15:07

【摘要】：非洲睡眠病是世界卫生组织重点监控的六大热带病之一,若不及时治疗,将致患者死亡。该病现主要流行于非洲36国,但伴随商贸和旅游业的发展,我国于2015-2017年亦出现三例输入性病例。布氏锥虫(Trypanosoma brucei)是引起非洲睡眠病的主要病原体,也是重要的研究模式病原生物。布氏锥虫细胞与哺乳动物细胞有诸多差异,布氏锥虫具有称之为“基体”的成对结构的细胞器,其主要由一个成熟的基体和一个原基体组成,与哺乳动物的中心体同源,具有参与调节细胞分裂和鞭毛合成的作用。基体是由上百个蛋白组成,但迄今仍有众多组成蛋白未被鉴定。本实验室前期鉴定出的基体候选蛋白BBP1,在布氏锥虫的细胞增殖中发挥着重要作用,但其具体功能还未被解析。本论文仔细研究了BBP1的胞内定位并阐明其分子水平上的生物学功能。首先,通过原核表达BBP1的特异多肽(Glu2-Glu400)并免疫新西兰兔,成功获得兔源抗血清。灵敏度检测结果显示,该抗血清对蛋白多肽的滴度为1:5×10~6,对全虫抗原滴度达到1:10~5,并且能够应用于免疫荧光手段,特异性标记目标蛋白。抗血清免疫荧光标记及YFP融合蛋白实验显示,锥虫细胞中BBP1蛋白信号仅出现于成熟基体,直至核G2期在新生原基体处也出现信号。其次,为了研究BBP1在布氏锥虫中的调控功能,构建了BBP1 RNA干扰虫株,结果显示BBP1干扰48小时后,锥虫细胞生长明显被抑制,细胞核型分析发现单个动基体多个细胞核(1KXN,占比24.33%)的异常细胞数目增加,72小时后出现多动基体多细胞核(XKXN,占比9.05%)的异常细胞,相应的正常的1K1N、2K1N和2K2N细胞比例显著下降(对照,97.96%;24 h,92.43%;48h,59.69%;72 h,34.22%)。通过定量分析DAPI标记的锥虫动基体DNA荧光强度显示,当细胞BBP1干扰24小时后,其动基体DNA发生不均等分裂现象。透射电镜分析这类异常细胞发现,它们的鞭毛二聚微管及中央微管发生缺失,暗示BBP1对锥虫鞭毛微管蛋白的稳定或装配具有重要作用。此外,锥虫的BBP1蛋白缺失也导致了细胞基体SAS6蛋白的装配异常以及新生鞭毛从胞体脱落的异常性状。最后,基体的一大标志特征是具有募集酪氨酸化α-tubulin的能力,可用抗体YL1/2标记观察。实验结果显示,干扰细胞中BBP1蛋白后,其定位于成熟基体处的YL1/2信号消失,但另一已知的功能相关蛋白TbRP2的定位和表达均未受到影响;而TbRP2 RNAi后BBP1的定位及酪氨酸化α-tubulin在基体的募集均受到了影响。综上所得,实验结果说明BBP1定位于成熟基体和原基体,装配入原基体的时间为细胞核G2期,对原基体成熟及鞭毛发育过程中起着重要作用,并能进一步影响动基体分裂和胞质分裂。而机制研究发现,BBP1的这些功能是通过影响基体募集酪氨酸化的α-tubulin而实现的。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R382.23
【图文】：

布氏锥虫,亚种,冈比亚,流行病学

2图 1-1 非洲睡眠病的流行病学分布：A）布氏锥虫冈比亚亚种；B）布氏锥虫罗德西亚亚种。红色由深到浅示各国由多到少的病例数。（引自 http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx）。Figure 1-1 Epidemiological distribution of humanAfrican trypanosomiasis.A) T. b. gambiense; BT. b. rhodesiense. Red blocks indicating the number of infection cases in respective contries (citedfrom http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx).

布氏锥虫,生活史,锥虫

图 1-2 布氏锥虫生活史。1-8 示各时期主要事件，详见正文。（引自 CDC: https://www.cdc.gov/parasites/sleepingsickness/biology.html）Figure 1-2 Life cycle of Trypanosoma brucei. 1-8 indicates the major event(s), more detailsavailable in text. (cited from CDC: https://www.cdc.gov/parasites/sleepingsickness/biology.html1.1.2.2 布氏锥虫的细胞结构基于 2012 年真核生物的分类系统，布氏锥虫隶属于动基体纲（Metakinetoplastina）锥虫目（Trypanosomatida）锥虫科（Trypanosomatidae）锥虫属（Trypanosoma）（Moreira et al., 2004；Adl et al., 2012）。布氏锥虫细胞呈锥形体，两端半径小，中间半径大，鞭毛自细胞中后部发出伸向前端（anterior）与细胞膜相连形成波动膜，部分伸出体前形成游离鞭毛。胞内具有真核生物常见的

布氏锥虫,模式图,鞭毛,横切面

6A）布氏锥虫细胞模式图（Matthews, 2005）；B）布氏锥虫扫描电镜图及成式图（Langousis & Hill, 2014）；C）鞭毛横切面模式图（Langousis & Hill, 2锥虫成熟基体透射电镜图：1-9 为纵切面（左）对应位置的由近端至远端的Vaughan & Gull, 2016）。-3A)Aschematic diagram of Trypanosoma brucei (Matthews, 2005). B) SEM owith schematic diagram of basal body and flagellum (Langousis & Hill, 2014). Cschematic diagram of flagellum (Langousis and Hill, 2014). D) TEM of T. bruceidy: 1-9 represent cross sections (right) from the proximal end to the distal end asng in vertical section (left) (Vaughan & Gull, 2016) .

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