新生SD大鼠嗅觉-海马发育水平与微压香氧机制探索

发布时间：2020-08-15 23:06

【摘要】：目的海马在空间学习、工作记忆及情境学习记忆活动中起到重要作用,对海马的发育和修复的探索也是中枢神经的研究重点。以海马-嗅觉通路的探索为治疗海马相关疾病提供思路嗅觉-嗅结节、嗅觉-内嗅皮质、嗅觉-杏仁核海马通路及嗅觉-海马通路是嗅觉在中枢神经系统中的四大重要通路。海马参与下的学习对海马突触和神经元发育有可塑性作用。以新生鼠为实验对象建立早期嗅觉学习模型以观察海马的功能活动和发育状况来探索相关影响因素。通过嗅觉对初级、次级脑环路进行刺激并激活相关脑区。在激活神经干细胞后经过嘴侧迁移流(Rostral migratory stream,RMS)将神经元输送至其他脑区,为神经修复提供帮助。这一研究以儿童发育入手为指导成年人脑功能修复如阿尔茨海默症提供依据。微高压氧(Micro-Hyperbaric oxygen,Micro-HBO)是微压香氧体系的重要组成部分,在整合医学中具有重要地位。实验讨论微高压氧干预对脑缺血再灌注大鼠神经功能及梗死面积的影响,探索微高压氧干预下梗死侧海马区内与轴突发育密切相关的生长相关蛋白(GAP-43)的表达变化。为探索临床脑缺血康复方法提供思路。第一部分早期气味学习诱导新生大鼠海马细胞增殖和轴突发育方法将出生6-7d(PN6-PN7)和出生后23-24d(PN23-PN24)的SD大鼠分别随机分为生理盐水+香草醛气味暴露组、生理盐水+乙醇气味暴露组、LiCl+香草醛联合学习组、LiCl+乙醇联合学习组和对照组(LiCl组)。各组大鼠接受2d学习,于最后一次学习后以Y型迷宫观察嗅觉偏好。为了解海马细胞增殖水平,采用BrdU标记2h内齿状回增殖细胞数,免疫印记实验检测c-fos和GAP-43的蛋白表达情况。结果1.Y型迷宫:PN7和PN24联合学习组的大鼠均较对照组对条件气味表现出较强的回避行为(F_((4,95))=13.66,F_((4,95))=9.211,),联合学习组表现出显著回避行为并且与气味暴露组存在差异。2.海马齿状回区细胞增殖水平:对PN7大鼠的增殖水平进行统计分析可见(F_((4,45))=38.432),PN7大鼠中联合学习组较LiCl组具有更高的细胞增长比,气味暴露组较对照组表现出更高的细胞增殖,但增殖水平不及LiC组。PN24各组大鼠在短期内细胞增殖水平差异不显著(F_((4,45))=0.561)。3.PN7大鼠海马齿状回区内神经元增殖水平:对PN7大鼠海马内β3 tubulin增殖表达进行统计分析可见(F_((4,45))=270.191),联合学习组的新生神经元的增长比较对照组更高,香草醛气味暴露组也较对照组表现出更高的增长。联合学习组也较气味暴露组表现出更高的神经元增长比。4.蛋白印记检测c-Fos表达:对PN7(F_((4.45))=184.313)和PN24(F_((4,45))=187.647)大鼠海马内c-Fos含量统计分析可见,PN7和PN24大鼠在联合学习组中表现出较对照组更高的蛋白表达。PN7和PN24大鼠中,气味暴露组较联合学习组有更高的蛋白表达,差异具有统计学意义。5.蛋白印迹检测GAP-43表达:在各组PN7大鼠中,GAP-43均具有较高的表达(F_((4,45))=21.454),气味暴露组和联合学习组均表现出较对照组更高的表达。对PN24大鼠海马内GAP-43蛋白表达统计分析可见(F_((4.45))=524.942),气味暴露组和联合学习组较对照组表现出更高的蛋白表达,联合学习组的蛋白均高于气味暴露组,香草醛气味暴露下的GAP-43表达较乙醇气味暴露下的蛋白表达更高。第二部分微压香氧对脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复及生长相关蛋白表达的影响方法采用Longa改良线栓法法制备短暂性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型。假手术组大鼠仅接受CCA、ECA结扎。完成tMCAO模型的大鼠随机分为模型组(术后1d和7d组)、微高压氧组(术后1d和7d组)、假手术组。MCAO大鼠各组接受Longa评估以筛选符合要求的大鼠并分组,对不同组大鼠进行脑缺血再灌注的对大鼠进行TTC染色观察各组大鼠脑缺血状况,为了解大鼠各组神经功能恢复状况采用免疫印迹检测生长相关蛋白43的表达变化。结果Longa行为评估:Longa评分主要用于评价个体神经功能水平。单因素方差分析显示,微高压氧1d组较模型1d组评分较优(F_((3,36))=7.005,P0.05)。微高压氧7d组评分低于模型7d组差异有统计学意义(P0.05)。7d组与1d组比较后未见统计学差异。模型组和微高压氧组间在1d组(P0.05)和7d组(P0.05)中均存在行为学评分差异,但随着时间的增加,差异减少。平衡木评分结果:平衡木实验多用于检测术后感觉运动功能的恢复情况。模型1d组评分低于微高压氧1d组,差异有统计学意义(F_((3,36))=13.079,P0.05)。微高压氧7d组评分较模型7d组评分更高(P0.05)。7d组在平衡木中的得分均较1d组的分数更高(P0.05;P0.05)TTC染色:根据TTC染色结果可见,除假手术组无梗死灶(全部红染)外,其他各组均可见不同程度的苍白色梗死灶。模型1d组梗死灶累及海马区且梗死面积较微高压氧1d组大。模型7d组较微高压氧7d组梗死跨度更大。对梗死面积百分比统计可见,7d组均较1d组个体梗死面积比更小(F_((3,16))=10.57,P0.05,P0.05)。微压氧干预组的梗死面积比低于模型组梗死面积比(P0.05,P0.05)。GAP-43蛋白印迹检测:假手术组的GAP-43显著低于各模型组和微高压氧组(F_((4,20))=46.959,P0.05;P0.05;P0.05;P0.05)。灰度值分析可以看出,1d的微高压氧组GAP-43表达较模型组显著提高(P0.05),7d组中微高压氧组的GAP-43含量也较模型组有所提升(P0.05)。对不同时间点的大鼠海马内GAP-43蛋白量分析发现,7d组均表现出较1d组更高的GAP43蛋白表达(P0.05,P0.05)。结论1.这些结果提示气味厌恶学习促进PN7大鼠海马的细胞增殖,对PN7和PN24大鼠和轴突发育可塑性均具有一定作用。可能对早期发育障碍大鼠在海马的生理和功能上具有修复作用。2.微高压氧干预有助于延长MCAO干预时间窗,帮助神经功能恢复并提升海马缺血处GAP43的蛋白表达以促进海马轴突再生。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R743;R-332
【图文】：

红色标记,细胞增殖,蓝色,学习方式

图 2 PN7 各组大鼠海马 DG 区细胞增殖水平如图所示，BrdU 以红色标记，DAPI 以蓝色标记。**P<0.01，***P<0.001 表示同一年龄下各组和 LiCl 组间比较； &&表示 P<0.0 同一气味物质不同学习方式之间比较。Li: LiCl 组；S+E: 生理盐水+乙醇；S+V: 生理盐水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛PN24 大鼠的 DG 区细胞密度显著低于 PN7 大鼠，齿状回形态和细胞数量较为接近成年大鼠，条件学习后各组细胞增殖变化较小（F（4，45）=0.561），未见统计学差异，不同气味和学习方式间未见显著差异。

红色标记,细胞增殖,蓝色,香草醛

图 3 PN24 各组大鼠海马 DG 区细胞增殖水平如图所示，BrdU 以红色标记，DAPI 以蓝色标记。Li: LiCl 组；S+E: 生理盐水+乙醇；S+V: 生理盐水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛。3.2.2 PN7 大鼠海马齿状回神经元细胞增殖用 β3 tubulin 对增殖细胞进行进一步探索后可见，PN7 大鼠在齿状回具有较高的新生神经元表达（F（4，45）=270.191），采用 Turkey 法对各组进行两两讨论分析可见，LiCl+乙醇组和 LiCl+香草醛组的新增神经元比 Li 组更高（分别：P<0.001,P<0.001）。生理盐水+香草醛组也较 LiCl 组有更高的神经元增殖比(P<0.01)。不同学习方式对神经元增殖比具有影响，气味联合学习后 DG 区的早期神经元细胞比较更高（分别为：P<0.001,P<0.001），但不同气味物质对早期神经细胞增值比的影响不大。

红色标记,颜色表,绿色,香草醛

图 4 PN24 各组大鼠海马 DG 区神经元增殖水平如图所示，BrdU 以红色标记，β3 tubulin 以绿色颜色表示。Li: LiCl 组；S+E: 生理盐水+乙醇；S+V: 生理盐水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛。**P<0.01，***P<0.001 表示同一年龄下各组和 LiCl 组间比较； && P<0.01 表示同一气味物质不同学习方式之间比较。3.3 神经元活动和突触发育相关蛋白变化3.3.1 即早基因 c-fos 在各组中的表现

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