嵌入型CpG佐剂及融合前构象F蛋白增强RSV疫苗免疫原性的研究

发布时间：2020-08-17 08:59

【摘要】：人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是一种非节段性、单股负链RNA包膜病毒,属于肺病毒科。RSV是导致婴幼儿和老年人呼吸道疾病的主要病毒病原,每年造成3千多万5岁以下儿童严重下呼吸道感染、6万多名儿童死亡。RSV被发现至今已有60多年,但到目前为止,仍然没有一种可用于预防病毒感染的有效疫苗。二十世纪六十年代,福尔马林灭活的病毒(formalin-inactivated RSV,FI-RSV)辅以铝佐剂的疫苗首先被用于婴幼儿RSV疫苗的研究。不幸的是,这种疫苗导致了接种婴幼儿严重的呼吸道疾病增强作用(enhanced respiratory disease,ERD)及极高的住院率,两名儿童因细支气管单核细胞浸润和嗜酸性粒细胞增多而死亡。FI-RSV导致ERD的原因有两个,一方面是中和抗体活性偏低,不能有效中和病毒;另一方面是疫苗诱导的Th2偏向的免疫应答在攻毒后可导致严重的肺部炎症。中和抗体活性偏低主要是由于FI-RSV表面缺失融合前F表位所致,而Th2偏向性免疫应答则是福尔马林灭活的病毒疫苗的特性之一。因此,安全有效、可用于婴幼儿的RSV候选疫苗应同时具有很好的中和活性以及诱导Th1偏向的免疫应答。本研究的创新点和主要内容总结如下:第一,CpG-C插入到质粒中能提高RSV DNA疫苗的免疫原性和保护性免疫应答,同时还具有Th1偏向的特点,可用于研发以婴幼儿为目标人群的RSV疫苗。本项研究中,我们对嵌入型CpG-C提高RSV DNA疫苗免疫原性的能力进行了评价。分别将5拷贝和20拷贝的CpG-C基序插入到携带有RSV F基因的质粒中,免疫小鼠后,我们发现,插入CpG-C基序能够使DNA疫苗诱导产生更高的血清抗体及中和抗体,同时能够产生更强的Th1偏向的免疫应答。在保护免疫小鼠抵抗病毒感染、降低肺组织病理和病毒复制、以及减轻体重下降等方面,插入20拷贝CpG-C序列的RSV DNA疫苗更加有效。第二,在F蛋白成熟的过程中,其F0前体被切割为两个亚单位和一个多肽片段后(F1、F2亚单位和27个氨基酸的多肽片段P27),P27被认为是非必要的短肽而被释放。为尝试获得融合前构象的F蛋白,我们将P27滞留在F2的C末端(命名为M1-F),结果证明,这样的改造具有稳定Pre-F结构的作用,与野生型F蛋白(F)相比,表达量没有下降,但M1-F在293T细胞中表达的融合前表位却显著高于F。本项研究中,我们通过突变位于F0前体的两个弗林酶切割位点,研究对F蛋白构象的影响。结果显示,无论是下游切割位点Ⅱ的单独突变(M2-F)还是联合上游切割位点Ⅰ的突变(U-F)均导致了相应突变的F蛋白M2-F和U-F表达量的急剧下降。而单一突变切割位点Ⅰ(M1-F),对蛋白的表达量并没有影响。同时,与F相比,在质粒转染的细胞表面,M1-F有更多的融合前表位。第三,为维持融合前M1-F蛋白结构的稳定性,我们设计、构建了一系列基于M1-F的突变体。经筛查,我们发现了能高效表达并且具有较高热稳定性的M1-F-1的突变体。同时以编码该突变体的质粒免疫小鼠,显示具有很好的免疫效力。本研究中,我们通过引入二硫键以进一步增强M1-F蛋白的热稳定性。突变体M1-F-1及M1-F-5有较高的表达量,因此对他们的热稳定开展进一步的研究。质粒表达的两种突变体蛋白,经55℃孵育10分钟,显示融合前(?)表位的稳定性明显高于F和M1-F;M1-F-5在V表位也显示出比F、M1-F和M1-F-1更强的稳定性。在综合分析表达量与稳定性的情况下,37℃孵育2天后,M1-F-1的(?)表位含量明显强于其它任何组别。另外,在4℃或-20℃孵育0至4天,M1-F-1均显示出较多的(?)表位含量。同时,与编码F蛋白的质粒相比,编码M1-F-1突变体的质粒免疫BALB/c小鼠产生的血清抗体显著较低,但其中和抗体滴度明显增加,RSV攻毒后,M1-F-1组小鼠肺脏的病毒滴度与肺组织损伤明显降低。综上所述,嵌入式CpG佐剂是增强RSV疫苗免疫原性及诱导产生Th1偏向的保护性免疫应答的有效方法,同时,突变F0前体上位于上游的弗林酶切割位点和引入二硫键可得到一种具有更多融合前表位和较高热稳定性的F蛋白,体内研究显示这种F蛋白突变体诱导保护性免疫应答的能力明显增强。这些工作为进一步获得具有自主知识产权的RSV疫苗奠定了重要基础。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

感染性,福尔马林,文献,载体疫苗

扰素的产量或活性，并发挥佐剂作用诱导机体产生增强的免疫应答［３４，３９，邋４Ｍ３］。而逡逑ｒＢＣＧ－Ｎ－ｈＲＳＶ是卡介苗与ＲＳＶ疫苗的嵌合型疫苗，因此该疫苗可以同时抵御结核逡逑分枝杆菌及ＲＳＶ病毒的感染［４４＿Ｍ邋（图１－３）。逡逑（３）载体疫苗逡逑载体疫苗是以病毒或细菌为载体，并将含有保护性抗原基因的载体导入宿主逡逑细胞中，在宿主细胞中表达保护性抗原并诱导机体产生免疫应答的疫苗。目前，逡逑处于临床阶段的ＲＳＶ载体疫苗中，ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ是以痘苗病毒安卡拉株为载体［４７，逡逑４８］，而邋ＣｈＡｄｌ５５－ＲＳＶ，邋ＶＸＡ－ＲＳＶ－ｆ邋和邋Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ邋均以腺病毒为载体（图邋１－３）逡逑［４９＿５２］。其中ＣｈＡｄｌ５５－ＲＳＶ以复制缺陷的１５５型黑猩猩腺病毒为载体，而ＶＸＡ－ＲＳＶｆ逡逑为Ａｄ５作为载体的口服疫苗，Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ是以Ａｄ２６为载体、以Ｐｒｅ－Ｆ为抗原逡逑的针对婴幼儿及老年人的疫苗。ＤＮＡ疫苗也属于载体疫苗，它是将含有抗原蛋白逡逑４逡逑

再折叠,融合肽,前结构,融合过程

转染的逡逑宿主细胞逡逑图１－４在ＤＮＡ疫苗的设计、配制和接种中提高体内转染效率和抗原免疫原性的关键因素（修逡逑改自文献＿）逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｋｅｙ邋ｆａｃｔｏｒｓ邋ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｄｅｓｉｇｎ，邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，邋ａｎｄ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｖａｃｃｉｎｅｓ邋ｔｏ逡逑ｉｍｐｒｏｖｅ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ａｎｄ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋［８５］）逡逑答的佐剂，而且还具有Ａ类及Ｂ类ＣｐＧ的生物活性。虽然目前还没有进入临床试逡逑验的报道，但己用于治疗感染性疾病、过敏及癌症的研究［７５，７９］。另外，ＣｐＧ－Ｃ序逡逑列还被插入到ＤＮＡ疫苗的载体中，以嵌入型佐剂的方式增强免疫应答以抵御细菌逡逑９逡逑

示意图,技术路线,示意图

我们同时可以引入一系列的突变，利用形成二硫键的方式稳定融合前逡逑结构，从而使抗原产生更高效的中和抗体，增强疫苗的保护性。逡逑该项研究的技术路线图如图１－７所示。通过上述研宄方案，研究ＣｐＧ－Ｃ佐剂逡逑对免疫应答类型的影响及其对免疫原性的提高。解决ＤＮＡ疫苗引起的免疫反应较逡逑弱的问题。而对Ｆ蛋白的改造，能够从抗原自身提高免疫保护作用，改造后的Ｆ逡逑蛋白不仅局限于ＤＮＡ疫苗，在腺病毒疫苗或亚单位疫苗都有很好的应用前景。逡逑值得一提的是，光信号检测技术在课题的研究过程中发挥了重要作用，如ＤＮＡ逡逑的检测与定量、蛋白质及其表位的定性与定量、血清抗体及中和抗体水平和病毒逡逑攻击后小鼠肺组织病毒感染状况等，这些技术及其原理和应用等见表１－３。其中，逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ、Ｄｏｔ邋ｂｌｏｔ、免疫荧光和酶联免疫吸附实验有着相近的实验原理（图１－８），逡逑１４逡逑

【相似文献】