轮状病毒VP7基因在拟南芥种子中的表达及免疫效果评价

发布时间：2020-08-18 08:56

【摘要】：轮状病毒(Rotvaiurs)引起的感染是全世界范围内,导致婴幼儿或幼畜病毒性腹泻的最主要原因。据统计,在发展中国家,由轮状病毒感染导致的儿童肠胃炎和脱水死亡达到60万-80万人/年。目前,人或动物受到轮状病毒的感染后,无有效治疗手段,利用葡萄糖等可暂时性补充腹泻引起的体液水平下降,但无法从根本上消除病毒的危害,由此造成的社会影响与家庭经济负担巨大。因此,研制一种安全而高效的轮状病毒疫苗,是人类健康所面临的严峻挑战。本研究从专利(US 7,285,280B1)获得人轮状病毒株外壳蛋白VP7基因序列(HRVVP7),针对大肠杆菌密码子偏好设计合成HRVVP7基因序列,构建原核表达载体pET-22b-HRVVP7,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。HRVVP7蛋白在包涵体和可溶性部分中,都有不同程度表达,优化BL21(DE3)诱导表达条件,确定诱导温度30℃,诱导时间9 h,IPTG诱导浓度1.0mM,为可溶性蛋白表达的最佳条件。镍柱亲和层析法纯化获得纯化的HRVVP7蛋白,为后续植物表达水平检测提供标准品蛋白。针对拟南芥密码子偏好设计合成HRVVP7-linker-CTB基因,以其为模板通过PCR方法获得优化的HRVVP7核酸序列,成功构建植物表达载体pPhaP3301-HRVVP7-linkerCTB和pPhaP3301-HRVVP7。农杆菌介导侵染拟南芥,草铵膦筛选获得阳性转基因拟南芥植株,Western blotting和ELISA检测和定量获得高表达量的T3代转基因拟南芥种子。为探索植物反应器多种途径生产HRVVP7,本研究利用红花组织培养技术,通过农杆菌介导转化pPhaP3301-HRVVP7至红花子叶中,对成活植株进行PCR验证,阳性植株收获种子后继续扩繁。收获T3代稳定遗传的转基因红花种子,通过SDS-PAGE、Western Blotting对HRVVP7蛋白进行检测和定性,利用ELISA定量分析,为植物生产轮状病毒疫苗提供新的可行途径。利用含有HRVVP7-linker-CTB与HRVVP7转基因拟南芥种子,提取可溶性总蛋白,经含量测定后免疫小鼠,分析本实验所制备植物疫苗的免疫效果。HVVP7-linker-CTB与HRVVP7转基因拟南芥种子蛋白样本,免疫组小鼠均能产生唾液、粪便、小肠粘膜IgA抗体与血清IgG抗体;血清IgG抗体具有较好的病毒中和能力;HRVVP7-linker-CTB与HRVVP7转基因拟南芥种子蛋白,免疫小鼠能够被动免疫子代小鼠。HRVVP7融合CTB蛋白在动物免疫实验中表现出优于HRVVP7蛋白效果。本研究首次在拟南芥及红花中表达了HRVVP7(US 7,285,280B1)基因,比较了融合CTB前后免疫效果的差异。实验为植物生物反应器生产轮状病毒亚基疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;R392
【图文】：

轮状病毒,粒子,文献,非洲绿猴肾细胞

在胰蛋白酶和胰凝乳酶等蛋白水解酶的辅助处理后，才能适合绿猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、MA104（现被更正为是非洲状病毒常用的细胞系。具有很强的传染性，在水体表面可存活数周，对理化因素变化仿、乙醚等有机试剂，反复冻融，超声波处理及 37℃下 1 小H 3.5-10.0范围内仍可保持感染力。臭氧、碘、氯、酚等试剂

轮状病毒,三维结构图,文献,毒蛋白

图 1.1 轮状病毒粒子(标记代表 100um)（摘自文献[13]）Fig.1.1 Virions of rotavirus (Marker represents 100 microns)毒蛋白特征，人们已经从完整的轮状病毒颗粒中鉴定出 11 种蛋白，分别VP6、VP7、NSPI、NSP2、NSP3、NSP4、NSPS[14]，分属于白（见图 1.2）。其中，结构蛋白 VP1、VP2、VP6、VP7 是毒的结构和功能的主要蛋白。VP1、VP2、VP3、NSPI、N 结合蛋白，对基因组的复制、合成及表达产生影响[15]。

疫苗,分布图,文献,轮状病毒

进入临床试验阶段的疫苗，中国的人-羊基因重配减毒活疫苗已经完验；UK基因重配 4价牛轮状病毒株疫苗（NIH,USA）；RV3新生儿人轮TBD, Australian)；新生儿人轮状病毒株疫苗（Bharat, USA/Indian)。已经病毒疫苗为 RIT－4237 牛轮状病毒株疫苗（Smithnine, Belgium）；WC3 苗（Wistar/Merenx, USA/France)； MMV-18006 猴轮状病毒株疫苗（NIHield 基因重配猴轮状病毒疫苗（Wyeth Lederle, USA）。目前，轮状病毒三个主要阶段：

【参考文献】