人核纤层蛋白病秀丽隐杆线虫模型的建立和机制研究
发布时间：2020-08-18 08:58
【摘要】：高等真核细胞的内层核膜下存在着一个纤维网络状的蛋白质片层结构,称为核纤层,其主体成分为核纤层蛋白(lamin)。Lamin是唯一的细胞核中间纤维,也是中间纤维超家族中最古老的类型,在后生动物中广泛存在并高度保守。人类基因组中有3个lamin基因:LMNA、LMNB1和LMNB2,其中LMNA通过可变剪接产生两种主要A型成员LMNA和LMNC,其表达受发育进程调控,而两种B型基因组成型表达,是细胞的必需基因。除LMNC外,其余3种蛋白的C末端均经历特殊的翻译后修饰。磷酸化是调节这些蛋白活性的重要手段,介导细胞周期中核纤层的可逆组装。Lamin可与多种内层核膜或核质蛋白直接或间接相互作用,通过这些功能各异的相关蛋白,作为结构分子的lamin,其功能也拓展到了细胞生命活动的各个方面,在DNA复制与修复、染色质组织、基因调控和信号转导等过程中均扮演着重要角色。Lamin基因突变或表达异常可导致多种临床表型高度异质的人类遗传性疾病,包括以进行性肌萎缩为主要特征的Emery-Dreifuss肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy,EDMD)和肢带型肌营养不良 1B 型(limb girdle muscular dystrophy type 1B,LGMD1B),以及造成小孩快速衰老的早衰症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)。这些疾病统称为核纤层蛋白病,LMNA突变为主要病因。虽然LMNA/C在成体中广泛表达,核纤层蛋白病却呈现出一定的组织特异性,根据受累的器官组织可分为5种类型:横纹肌疾病、脂肪营养不良、神经疾病、早衰和混合型。组蛋白分子伴侣RBBP4/7的丢失是HGPS和自然衰老进程中的重要事件,而在分别表现为EDMD和LGMD1B的两位患者的原代成肌细胞中,RBBP4/7也出现定位或表达异常,表明其可能是多种核纤层蛋白病的共有病理因子。模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中,RBBP4/7有两个同源蛋白——LIN-53和RBA-1,其中lin-53的干涉或突变可导致线虫肌肉缺陷和寿命缩短,也即具有类似核纤层蛋白病的表型,因此我们希望能以C.elegans为疾病模型探究lin-53/rba-1与核纤层蛋白病的关系,同时利用C elegans的活体高通量优势进一步解析核纤层蛋白病的致病机制,为治疗提供新的思路和更多的可能。C.elegans体壁肌肉的结构和功能与脊椎动物骨骼肌高度相似,为其被作为横纹肌疾病模型提供了可行性。于是,我们将EDMD和LGMD1B的致病突变引入了 C.elegans的单个lamin基因lmn-1,通过显微注射法构建了肌肉特异性表达的转基因嵌合株,随后以γ射线照射法获得了转基因整合株。通过游泳实验、免疫染色和Pmyo-3::GFP报告基因等证实这些转基因突变体重现了两位患者的肌肉缺陷表型,成功获得了 EDMD和LGMD1B的线虫模型。而寿命实验显示,突变体的生存能力所受影响较小。我们还通过MosSCI法获得了单拷贝定点整合的转基因突变体,在lmn-1-/-背景下也出现了肌肉表型。另外,我们还构建了广泛表达的转基因突变体,并观察到肠细胞核的形态异常。另一方面,通过LIN-53和RBA-1的表达模式检测,我们发现野生型N2雌雄同体成虫中LIN-53广泛表达,而RBA-1却局限在生殖系细胞中,也即LIN-53独自承担成体肌细胞功能。功能性融合蛋白GFP::LIN-53::2xFLAG的外源表达表明LIN-53对肌肉稳态具有重要作用。免疫染色显示,在EDMD和LGMD1B突变体,以及具有早衰表型的lmn-1-/-纯合子中,LIN-53的表达均出现下降或缺失,表明其可能是多种核纤层蛋白病的共有病理因子,且这一机制可能在进化上保守。此外,我们还利用MH染色质亚库对～700个线虫基因进行了 RNAi筛选,获得了 3个经敲低后可以缓解突变体肌肉表型的因子,且这种抑制效应由游泳实验进一步证实。综上所述,本研究建立了 EDMD和LGMD1B的线虫疾病模型,发现组蛋白分子伴侣LIN-53可能是一种共有病理因子,并筛选出3个核纤层蛋白病相关因子,为进一步解析核纤层蛋白病的分子机制和治疗药物开发等后续研究提供了基础和依据。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R596;R-332
【图文】：
（１）ＬＭＮＡ逡逑ＺＭＶｄ位于常染色体ｌｑ２２，基因组全长为５７．５邋ｋｂ，含有１７个外显子序列（ＮＣＢＩ逡逑ｇｅｎｅ邋ＩＤ：邋４０００）。经典ＺＭＶ＾，也即ＬＭＮＡ／Ｃ的编码基因，由１２个外显子组成（图１－逡逑２），产生至少４种异构体：Ａ、ＡＡ１０、Ｃ和Ｃ２。逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋ｓｐｌｉｃｅ邋ｓｒｔｅ逡逑ｓ，—逦ｆ逦＇…，逦＇邋—－邋３，逡逑ｌｍｎａ邋Ｈ逦—Ｗｕ—￣Ｈｍ—￣１２邋＿ｒ逡逑：＼逦＼逦ｔ逦＼逡逑／邋；逦＼逦ＬＭＮＣ邋Ｂ＾ＴＲ逦＼逡逑，■邋／邋；邋＼邋＼逡逑ｌ邋＊‘逦、逦＼逡逑３３逦３８３逦６６４逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋二——一：｜逡逑ＣｏｉｌｌＡ逦ＣｏｉｌｌＢ逦Ｃｏｉｌ２Ａ逦Ｃｏｉｌ２Ｂ逦ＮＬＳ逦ｉｇ－ｆｏ！ｄ逦ＣａａＸ逡逑３３逦３８３逦Ｓ７２逡逑ＣｏｉｌｌＡ逦Ｃｏｉ！１８逦Ｃｏｉｌ２Ａ逦Ｃｏｉｆ２Ｂ逦ＮＬＳ逦Ｉｇ－ｆｏｌｄ逡逑图１－２邋ＺＭＡＭ基因和主要产物示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｉＬＭＮＡ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｍａｊｏｒ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑ＬＭＮＡ／Ｃ的编码基因又＿由１２个外显子组成，通过外显子１０内的选择性剪接生成两种主要产物逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ和ＬＭＮＣ，二者的３个结构域的末端氨基酸残基位置标在各自上方，结构组成同图１－１。逡逑ＬＭＮＡ以前体的方式表达
有丝分裂位点的磷酸基团由蛋白a愃崦福卞澹ǎ穑颍铮簦澹椋铄澹穑瑁铮螅穑瑁幔簦幔螅邋澹保校校保┤コ瑰义希欤幔恚椋畹靡栽诜至涯┢冢纾牵逼谖谱湃ヅㄋ醯娜旧逯匦伦樽拔危蹋郏矗叮矗罚荨ｅ义贤ü鸺蹲芭洌欤幔恚椋羁稍谔逋庾宰樽拔肿酉宋峁梗郏福矗福澹矗梗荩缤迹保此荆海保╁义鲜紫扔闪礁龅ヌ澹ǎ恚铮睿铮恚澹颍┩ü俗辞酝蚱叫星叶云氲姆绞奖舜瞬菩纬啥厶邋义希ǎ洌椋恚澹颍╁澹诲澹玻┒喔龆厶逡宰菹蛲肺蚕嘟樱ǎ瑁澹幔洌簦铮簦幔椋欤┑姆绞叫纬纱樽吹亩嗑厶邋义希ǎ穑铮欤恚澹颍诲澹常┝礁黾远嗑厶逶僖苑聪蚱叫卸糠纸淮淼姆绞讲⑴抛樽拔羌缘乃腻义暇厶逶宋ǎ穑颍铮簦铮妫椋欤幔恚澹睿簦诲澹矗持粒锤宋舜瞬嘞蜃樽拔浚保板澹睿淼模桑平峁埂Ｐ柚稿义铣龅氖牵庖蛔樽跋附诠楣τ谛阙钜讼叱妫澹澹纾幔颍幔┑模蹋停危卞文壳板义衔ㄒ灰桓隹梢栽谔逋庾樽拔桑平峁沟模欤幔恚椋睢Ｆ渌欤幔恚椋罱瞿茉诙嗑厶宓幕∩献莺峤诲义洗砦行虻淖季逑宋ǎ穑幔颍幔悖颍螅簦幔欤欤椋睿澹妫椋猓颍澹
本文编号：2796012
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R596;R-332
【图文】：
（１）ＬＭＮＡ逡逑ＺＭＶｄ位于常染色体ｌｑ２２，基因组全长为５７．５邋ｋｂ，含有１７个外显子序列（ＮＣＢＩ逡逑ｇｅｎｅ邋ＩＤ：邋４０００）。经典ＺＭＶ＾，也即ＬＭＮＡ／Ｃ的编码基因，由１２个外显子组成（图１－逡逑２），产生至少４种异构体：Ａ、ＡＡ１０、Ｃ和Ｃ２。逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋ｓｐｌｉｃｅ邋ｓｒｔｅ逡逑ｓ，—逦ｆ逦＇…，逦＇邋—－邋３，逡逑ｌｍｎａ邋Ｈ逦—Ｗｕ—￣Ｈｍ—￣１２邋＿ｒ逡逑：＼逦＼逦ｔ逦＼逡逑／邋；逦＼逦ＬＭＮＣ邋Ｂ＾ＴＲ逦＼逡逑，■邋／邋；邋＼邋＼逡逑ｌ邋＊‘逦、逦＼逡逑３３逦３８３逦６６４逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋二——一：｜逡逑ＣｏｉｌｌＡ逦ＣｏｉｌｌＢ逦Ｃｏｉｌ２Ａ逦Ｃｏｉｌ２Ｂ逦ＮＬＳ逦ｉｇ－ｆｏ！ｄ逦ＣａａＸ逡逑３３逦３８３逦Ｓ７２逡逑ＣｏｉｌｌＡ逦Ｃｏｉ！１８逦Ｃｏｉｌ２Ａ逦Ｃｏｉｆ２Ｂ逦ＮＬＳ逦Ｉｇ－ｆｏｌｄ逡逑图１－２邋ＺＭＡＭ基因和主要产物示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｉＬＭＮＡ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｍａｊｏｒ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑ＬＭＮＡ／Ｃ的编码基因又＿由１２个外显子组成，通过外显子１０内的选择性剪接生成两种主要产物逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ和ＬＭＮＣ，二者的３个结构域的末端氨基酸残基位置标在各自上方，结构组成同图１－１。逡逑ＬＭＮＡ以前体的方式表达
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本文编号：2796012
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