金黄色萄萄球菌ArlR-MgrA调控级联对Rbf及生物被膜形成的调控机制研究

发布时间：2020-08-18 11:45

【摘要】：金黄色葡萄球菌是细菌感染最常见的病原体之一,可引起从轻微的皮肤感染到严重的深层感染如骨髓炎、肺炎等一系列疾病。生物被膜是金黄色葡萄球菌感染治疗急需解决的问题,其主要成分是胞外多糖PIA、胞外蛋白质以及胞外DNA,能够为细菌提供保护,使其免受抗生素的杀伤及造成免疫逃逸。转录因子Rbf被报道参与促进ica操纵子转录以及PIA产生,从而促进生物被膜形成。实验室前期工作预示Rbf受到LuxS/AI-2系统的抑制,可能是群体感应系统LuxS/AI-2系统中自诱导分子AI-2的潜在受体,在群体感应系统调控生物被膜形成中也起着重要作用。因此我们针对其进行了一系列实验,希望能够完善以Rbf为中心的生物被膜调控网络。我们的实验结果发现,金黄色葡萄球菌二元信号系统ArlR以及全局调控因子MgrA共同组成ArlR-MgrA调控级联,对Rbf有着直接的抑制作用,是Rbf上游直接的调控因子。ArlR-MgrA调控级联可以通过对Rbf的抑制间接调控下游的ica操纵子以及PIA合成,同时ArlR-MgrA调控级联还可以直接结合ica操纵子的启动子区域直接促进其转录以及PIA产生。综合突变株的icaA基因转录水平以及PIA的定量实验证明,ArlR-MgrA调控级联对于ica操纵子的调控以直接的促进作用为主。胞外金属蛋白质酶Aur可以切割丝氨酸蛋白质酶SspA使其成熟,成熟的SspA可以切割半胱氨酸蛋白质酶SspB使其具有活性,这些蛋白质酶对生物被膜都有一定的抑制作用。我们发现Rbf对于胞外蛋白质酶Aur具有直接的抑制作用,证实Rbf对于生物被膜的促进作用并不仅仅依赖于增强PIA的产生。随后我们发现ArlR-MgrA调控级联通过抑制Rbf对aur基因存在正向调节,同时ArlR-MgrA 调控级联也可以直接结合 aur 基因的启动子直接促进其表达。这些结果证明ArlR和MgrA主要通过促进胞外蛋白质酶Aur的表达来实现对生物被膜的抑制作用。σ~B是金黄色葡萄球菌中重要的σ因子,对于ica操纵子存在不依赖icaR基因的抑制作用,同时对包括Aur在内的胞外蛋白质酶也有抑制作用。我们的实验结果显示无论在σ~B失活的NCTC8325菌株中或是σ~B活性恢复的菌株中,上述调控通路均未受明显影响,即本实验发现的调控通路为非σ~B依赖的。同时实验还研究了 LuxS/AI-2群体感应系统对Aur的调控,发现LuxS/AI-2系统并不通过对Rbf的调控作用影响Aur的水平。最后,我们还探究了金黄色葡萄球菌NCTC 8325二元信号系统SAOUHSC_01314的部分功能,证实其可以通过抑制Aur的水平来增强生物被膜的形成。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R378
【图文】：

显微形态,金黄色葡萄球菌

ｔａｐｙｏｃｏｃｃａｃｅａｅ／ａ／ｏｃｏｃｃｗｓ。ｐ７＿ｙ萄状的，“ｃｏｃｏｗ”意思为球状，“ａｗｒｅｒｗ”意思为金黄色，因其菌落在金黄色而得名。德国内科医师及微生物学家Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ在１８８４年葡萄球菌加以命名，并将其与表皮葡萄球菌（ｉＳＶａｐ／ｉｙ／ｏｃｏｃｃｔｗｅｐ／ｄｍ来。逡逑金黄色葡萄球菌属于革兰阳性菌，单个球菌直径大约为0．７－１．２＾ｍ，镜下呈现葡萄串状，没有芽胞及鞭毛。由于金黄色葡萄球菌的分裂菌体分裂缓慢，因此显微镜下观察多见四联体，子代细胞不能完全持粘附，导致呈现成簇的葡萄状。金黄色葡萄球菌对于生长环境的，在普通培养基内即可生长良好。金黄色葡萄球菌生长过程为需氧最适生长温度为３７°Ｃ，最适生长ｐＨ值为７．４。其在平板上形成的伴有光泽，一般为圆形凸起，直径为１－２邋ｍｍ。由于金黄色葡萄球ａ－溶血素和Ｐ－溶血素，所以血平板上生长的菌落周围可形成透明的温有氧条件下，金黄色葡萄球菌菌落生长到一定大小后，会由0８类胡萝卜素，因此菌落多呈现金黄色，而在无氧条件下这一过程ｔｚｉｆ邋ｅｔ邋ａｌ．邋２００５；邋Ｌｏｗｙ邋１９９８ａ）。逡逑

毒力因子,金黄色葡萄球菌,来源,图片

逦第一章实验背景逦逡逑细胞的趋化作用，可以降低粒细胞的吞嗟杀伤能力（Ｌｅｅ邋ａｎｄ邋Ｉａｎｄｏｌｏ邋１９８６）。逡逑（１２）凝固酶逡逑血浆凝固酶可以促使添加了枸椽酸钠或肝素等抗凝剂的血浆发生凝固，常出逡逑现于致病菌株中，是鉴定葡萄球菌有无致病性的重要标志。凝固酶有两种：一种逡逑称作游离凝固酶（ｆｒｅｅｃｏａｇｕｌａｓｅ），由金黄色葡萄球菌合成后分泌至胞外，通过与逡逑凝血酶原协同作用，促使纤维蛋白质原转变为纤维蛋白质，最终导致血浆凝固；逡逑另一种称作结合凝固酶（ｂｏｕｎｄ邋ｃｏａｇｕｌａｓｅ）或凝聚因子（ｃｌｕｍｐｉｎｇ邋ｆａｃｔｏｒ），由金逡逑黄色葡萄球菌合成后结合在菌体表面并不脱落，但不属于细菌表面物质，通过结逡逑合纤维蛋白质原而使细菌凝聚（Ｐａｎｉｚｚｉｅｔａｌ．２００４）。目前凝固酶在金黄色葡萄球菌逡逑致病过程中的具体功能并不清楚，但有实验表明其对肺炎的产生十分重要，同时逡逑对急性心内膜炎的发生也有一定的贡献（Ｌｏｗｙ邋２０００）。逡逑

生物被膜,不同尺度

逡逑最初ｅＤＮＡ只被视作细胞裂解的产物，但目前越来越多的研宄显示ｅＤＮＡ逡逑作为整合在生物被膜基质中的一部分参与整个生物被膜的生命周期（Ｍｏｌｉｎ邋ａｎｄ逡逑Ｔｏｌｋｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ邋２００３）。ｅＤＮＡ的主要作用之一是促进菌体的聚集，对能够自身絮逡逑凝的小红卵菌属的研宄显示，利用核酸酶处理可使小红卵菌属的细菌去絮凝化，逡逑而多糖降解酶和蛋白质降解酶均没有作用（Ｗａｔａｎａｂｅｅｔａｌ．邋１９９８）。而在铜绿假单胞逡逑菌的生物被膜中，ｅＤＮＡ充当着胞间连接物的角色。同时ｅＤＮＡ还可以螯合阳离逡逑子，起到稳定脂多糖和细菌外膜的作用（Ｙａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．邋２００７）。逡逑ｅＤＮＡ的定位在不同的生物被膜中也有很大不同。在铜绿假单胞菌的生物被逡逑膜中，ｅＤＮＡ形成网格状结构，而在水生细菌变形菌中，ｅＤＮＡ形成纤维状网络逡逑（Ａｌｌｅｓｅｎ＿Ｈｏｌｍｅｔａｌ＿２００６；Ｂ６ｃｋｅｌｍａｎｎｅｔａｌ．２００６）。而在蘑薛型菌落中，ｅＤＮＡ邋以逡逑时间依赖的模式定位在茎部顶端，浓度高于其它部位，成为茎部和帽区的分界，逡逑这一现象可能有利于菌体的聚集，从而形成帽区（Ａｌｌｅｓｅｎ邋－邋Ｈｏｌｍｅｔａｌ．邋２００６）。逡逑在一些菌株中，ｅＤＮＡ虽然与基因组ＤＮＡ有某种程度上的相似性，但仍存逡逑在显著差异，表明这些ｅＤＮＡ并不是简单来源于细胞裂解。而在另一些菌株中如逡逑铜绿假单胞菌，ｅＤＮＡ与基因组ＤＮＡ完全相同（ＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒａｎｄＨｏｌｄｅｎ２００５）。因逡逑此，ｅＤＮＡ的来源仍值得进一步研宄。逡逑

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