E3泛素连接酶TRIM40负向调控抗病毒天然免疫应答及其机制研究

发布时间：2020-08-20 13:14

【摘要】：天然免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。在病毒入侵机体之后,宿主的模式识别受体(PRR,pattern recognition receptors)能够迅速识别来自病毒的病原相关分子模式(PAMP,pathogen-associated molecular patterns),并积极做出免疫应答。维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族(RLR,retinoic acid-inducible gene-Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors)是新近发现的RNA识别受体。RLR包括三个成员,分别是 RIG-Ⅰ,黑色素瘤分化相关抗原 5(MDA5,melanoma differentiation-associated gene 5)和遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2,laboratory of genetics and physiology 2)。RIG-Ⅰ和MDA5在识别外源RNA之后,可以通过一系列信号活化引起Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子的大量表达,从而帮助机体迅速建立起应对病毒的状态。另一方面,MDA5和RIG-Ⅰ的过量表达及活化还能够引起自身免疫疾病及自身炎症疾病的发生。因此,MDA5及RIG-Ⅰ的表达及活化需受到精确调控,有关其精确调控方式与相关机制的研究是天然免疫领域的前沿热点。泛素化修饰是调节RIG-Ⅰ及MDA5分子表达及活性的重要的翻译后修饰(PTM,post-translation modification)之一。已知 TRIM25(tripartite interaction motif 25)、TRIM4、RNF135(RING finger protein 135)、MEX3C、RNF125、RNF122、c-Cbl 和 CHIP(carboxyl terminus of HSC70-interacting protein)能够通过对 RIG-Ⅰ进行K63位或K48位泛素化修饰而调节RIG-Ⅰ的活化或表达。然而,是否存在通过泛素化修饰从而调节MDA5的表达及活性的E3泛素连接酶目前尚不清楚;是否存在能够精确调控RLR表达的其他类型泛素化修饰也需要进一步明确。TRIM40是E3泛素连接酶TRIM家族成员之一。TRIM40定位于主要组织相容性复合体Ⅰ类基因区(MHC Ⅰ),与其他多个TRIM家族分子共同形成了一个紧密基因簇。多项研究表明,位于该基因簇的TRIM成员在天然免疫调节方面具有重要作用,包括TRIM15、TRIM26、TRIM31和TRIM39等。然而,TRIM40分子在天然免疫调节中是否发挥作用尚不清楚。在本文中,我们发现TRIM40缺陷能够特异性促进RNA病毒仙台病毒(SeV,Sendai virus)和水疱性口炎病毒(VSV,vesicular stomatitis virus)感染引起的 IFN-β及炎症因子的表达,而对LPS和poly(I:C)诱导的信号通路没有影响。对TRIM40缺陷细胞进行MDA5和RIG-Ⅰ特异性配体(长链和短链poly(I:C))转染,可发现IFN-β转录较野生型细胞均有上调。通过报告基因检测IRF3和NF-κB启动子区活性,及Western blot检测SeV感染后信号分子的磷酸化水平,发现TRIM40特异性抑制RLR介导的IRF3和NF-κB信号通路活化。RNA病毒感染后,TRIM40表达下调,说明TRIM40是抗病毒天然免疫反应中的反馈调节因子。体内实验发现,Trim40-/-小鼠腹腔注射SeV或VSV病毒后,能引起更强烈的天然免疫反应,且生存率显著提高。我们进一步对TRIM40作用机制进行了研究。通过向HEK293T细胞中高表达RLR信号通路中的相关信号分子进行报告基因实验发现,TRIM40的作用位点位于MAVS或MAVS上游。免疫共沉淀实验进一步确认TRIM40能够与MDA5和RIG-Ⅰ结合。利用截短体质粒及免疫共沉淀实验发现TRIM40可以通过其CC(coiled-coil)结构域与 MDA5 和 RIG-Ⅰ 的 CARD(caspase activation and recruitment domain)结构域结合。chase 实验证明 TRIM40 参与了 MDA5 和 RIG-Ⅰ的降解过程,同时MDA5和RIG-Ⅰ的降解过程可被蛋白酶体抑制剂逆转,说明TRIM40对底物的降解是通过蛋白酶体途径。二次免疫共沉淀检测MDA5及RIG-Ⅰ泛素化修饰情况,证实了 TRIM40能够直接催化MDA5和RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化修饰。我们利用MDA5及RIG-Ⅰ CARD结构域截短体,证明了 TRIM40能够通过泛素-蛋白酶体途径降解MDA5及RIG-Ⅰ CARD结构域并下调RLR信号通路活化。为明确TRIM40对MDA5和RIG-Ⅰ的作用位点,我们构建了位于MDA5 CARD结构域上的点突变体,确定了 TRIM40催化MDA5的多聚泛素化修饰位点是K23、K43和K68。我们的研究揭示了 TRIM40通过介导MDA5、RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化降解从而抑制RLR信号通路及IFN-β产生的分子机制;首次发现了 MDA5和RIG-Ⅰ的K27位泛素化并证实K27位泛素化修饰参与了蛋白酶体途径的降解;首次确定了 MDA5能够发生泛素化修饰的位点。我们的发现丰富了参与抗病毒天然免疫反应的调控网络的基础研究,也为抗病毒和自身免疫疾病的未来治疗提供了潜在的靶点与新思路。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392
【图文】：

人源仞基因位于ＭＨＣ邋Ｉ类分子基因区，介于ＨＬＡ－Ａ和ＨＬＡ－Ｅ之间；逡逑类似地，鼠源基因则定位于小鼠ＭＨＣ邋Ｉ基因区相应的Ｈ２－Ｍ及Ｈ２－Ｔ之逡逑间（图１．１），与多种ＴＲＩＭ家族分子形成了紧密的基因簇。由于该基因簇内多种逡逑ＴＲＩＭ分子均在天然免疫中发挥重要作用，提示了邋ＴＲＩＭ４０也可能参与天然免疫逡逑调控。逡逑Ａ逦一逡逑０．１Ｍｂ逡逑Ｈｕｍａｎ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ邋６逡逑？番逦Ｉ逡逑？逦＂＂＂邋ｔ邋ｒ邋Ｔ邋Ｔ逡逑ＬＵ逦0逦＜邋Ｏ邋ＬＬ逡逑ｉ逦ｉｉｉ逡逑工逦ａ：逦工工工逡逑Ｂ逦０．１Ｍｂ逡逑Ｍｏｕｓｅ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ邋１７逡逑ｉ逦？馨寒逦《｜（｜｜（｜＿蠢逡逑Ｉ逦ｉ逦Ｉ逡逑２逦ＯＨ逡逑空逦Ｉ空逡逑N逦ｃｒ逡逑Ｈ逡逑图１．１邋７Ｗ／ｗ洲基因位于ＭＨＣ邋Ｉ类分子基因区逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｒｉｍ４０邋ｇｅｎｅ邋ｌｏｃａｔｅｄ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ邋ｃｌａｓｓ邋Ｉ邋ｒｅｇｉｏｎ．逡逑（Ａ）邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ＴＲＩＭ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｍｅｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ逡逑ｈｕｍａｎ邋ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．邋（Ｂ）Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ＴＲＩＭ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑ｍｅｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｈｏｕｓｅ邋ｍｏｕｓｅ邋ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．逡逑为了研宄ＴＲＩＭ４０是否在天然免疫调控中发挥作用

ＴＲＩＭ４０缺陷细胞能够显著上调ＲＮＡ病毒仙台病毒（ＳｅＶ）及水疱性口腔炎病毒逡逑（ＶＳＶ）诱导的ＩＦＮ－ｐ以及炎性细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－６分泌，而ＬＰＳ及ｐｏｌｙ邋（Ｉ：Ｃ）逡逑处理后并无变化（图１．３Ａ－Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑１５０１逦＾邋＊＊逦□邋ｒｒ／ｍ４０＊Ａ邋４０１逦□邋Ｔｒｉｍ４０ｔｎ逡逑：逦．一邋■邋Ｔｒｉｍ４０＇邋一逦２邋ｎｓ邋■Ｔｒｉｍ４０ｌ逡逑ｒ邋ｕ＼ｍｔＭｌ逡逑１邋ｉＪＩｌｌｌ．邋＾邋：ｕｉｋ逡逑ｃ逡逑ＡＨ邋ｎ逡逑＊＊逦ｎｓ逦□邋Ｔｒｉｍ４０Ｈ＊逡逑＾逦＾逦■邋Ｔｒｉｍ４（ｙ逡逑ｉ２０－逦ｎ逦ｄ逡逑？邋１０．逦ｔ．＊邋Ｉ逡逑0Ｌ．－ｎ｜邋１１１邋ｌｌｌａｉ逡逑￥孑彡夕ｆ逡逑图１．３邋ＴＲＩＭ４０特异性抑制ＲＮＡ病毒引起的细胞因子分泌逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋ＴＲ１Ｍ４０邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ邋ＲＮＡ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．逡逑（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－Ｐ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｔｒｉｍ４０＋／＋逡逑２２逡逑

在外源性实验中，ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中过表达ＴＲＩＭ４０全长质粒能够显著抑制逡逑ＳｅＶ诱导的ＩＦＮ－ｐ报告基因活性，而高表达缺失ＲＩＮＧ结构域的ＴＲＩＭ４０截短体逡逑质粒则对ＩＦＮ－（３报告基因活性没有影响（图１．５）。逡逑．逦ｎｓ逡逑％邋１５］逦□邋Ｃｔｒｌ逡逑｜逦Ｔ邋Ｔ邋■邋ＴＲＩＭ４０逡逑０邋１０－逦｜｜邋W邋ＴＲＩＭ４０ＡＲＩＮＧ逡逑＾邋Ｃ0会逡逑图１．５邋ＴＲＩＭ４０特异性抑制ＲＮＡ病毒诱导的ＩＦＮ－Ｐ表达逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．５邋ＴＲＩＭ４０邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ邋ＲＮＡ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＩＦＮ－ｐ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．逡逑ＨＥＫ２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＩＦＮ－Ｐ邋ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｐｌａｓｍｉｄ，邋ｔｏｇｅｔｈｅｒ邋ｗｉｔｈ逡逑ＴＲＩＭ４０，邋ＴＲＩＭ４０邋ＲＩＮＧ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ邋ｍｕｔａｎｔ邋（ＡＲＩＮＧ）邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｐｌａｓｍｉｄ，逡逑ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＳｅＶ邋ｆｏｒ邋１２邋ｈ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ逡逑ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ａｎｄ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎｓ邋±邋ＳＤ．邋＊，ｐ＜０．０５，邋＊＊，／？＜０．０１．逡逑为进一步验证以上现象确实是由ＴＲＩＭ４０所引起的，我们利用ＴＲＩＭ４０基因逡逑敲除小鼠胚胎成纤维细胞进行了回复实验。结果发现，ＴＲ１Ｍ４０缺陷细胞较野生逡逑型细胞在ＳｅＶ感染后能够引起更多的ＩＦＮ－（３转录

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