利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究

发布时间：2020-08-22 13:00

【摘要】：研究背景:近些年来,泛耐药菌和多重耐药菌的检出率不断上升,针对一线抗生素的耐药率逐渐升高。特别是随着超级耐药菌的出现,抗感染治疗面临无药可用的局面。细菌耐药性的快速流行已成为一个亟待解决的全球性卫生问题。耐药基因往往定位于细菌质粒,具备极强的跨菌种水平转移能力。目前针对泛耐药菌和超级耐药菌的治疗方式及其有限,尚无有效的技术手段阻断耐药性的扩散转移。耐药菌感染治疗、防控等领域亟需新技术和新策略。CRISPR-Cas9基因编辑技术来源于细菌的特异性免疫机制CRISPR系统,能够对目的DNA实现序列特异性的剪切。近年来已有研究报道将CRISPR系统包装至温和噬菌体中,通过噬菌体递呈CRISPR系统,致死性地剪切细菌靶基因。这些研究提供了利用CRISPR工具对抗耐药菌的思路,但还遗留很多缺陷。首先,之前的研究主要通过温和噬菌体递呈CRISPR靶向细菌染色体的策略进行杀菌,缺少靶向质粒策略抗耐药菌效果的深入分析,尤其缺少体内实验数据。其次,当前研究显示的噬菌体递呈CRISPR技术杀菌效力有限,远远低于传统的烈性噬菌体杀菌技术,达不到实用水平。另外,噬菌体包装技术需要改进以避免抗性筛选标记被引入包装后的噬菌体基因组,并提高包装噬菌体的效率和对新噬菌体的适用性。最后,以往研究只评价了1~2天内包装CRISPR-Cas噬菌体的抗菌能力,还需要在更长的观测时间里进行持续观测和分析。研究目的:细菌耐药性主要由耐药质粒进行介导和传播。利用原核CRISPR-Cas9基因编辑技术清除细菌耐药质粒,能够恢复抗生素的杀菌效力,并阻断细菌耐药性的传播。利用更加高效的原核载体技术,携带靶向细菌耐药质粒的CRISPR-Cas9系统更加高效的向耐药菌递呈,将大大增加该系统在抗耐药菌领域的实际应用潜力。本研究将建立CRISPR-Cas9高效清除细菌耐药性技术。设计并构建特异性CRISPR-Cas9系统来分析靶向清除NDM-1耐药质粒的效果。在此基础上,我们利用温和噬菌体作为CRISPR-Cas9系统的高效递呈载体。通过研发新型温和噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,实现CRISPR系统的“一步法”包装,探索从温和噬菌体分离到完成包装的技术流程。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统,在一系列的体内外实验中检验细菌耐药性的清除效率,并分析联合抗生素抗耐药菌策略。通过持续监测对耐药菌生长的抑制效果,分析噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的细菌耐受突变的产生,是否具有比烈性噬菌体直接杀菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立针对超级耐药基因bla_(NDM-1)的CRISPR-Cas9靶点spacer文库,构建靶向NDM-1质粒的CRISPR-Cas9系统质粒。构建携带NDM-1质粒的耐药大肠杆菌模型,采用定量PCR及荧光信号检测等方法分析CRISPR-Cas9系统清除NDM-1质粒的效率,药敏实验检验耐药质粒清除后细菌耐药表型的变化。通过上述实验验证CRISPR-Cas9系统高效清除细菌耐药质粒的能力。设计引入抗性筛选的新型重组噬菌体筛选系统,建立“一步法”温和噬菌体整合CRISPR-Cas9技术。采用该包装技术改造一株新分离的大肠杆菌温和噬菌体,使其递呈CRISPR-Cas9系统,并靶向剪切携带bla_(NDM-1)靶点的质粒。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体侵染携带靶质粒的大肠杆菌,分析噬菌体递呈的CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的能力,包括PCR检测靶质粒的清除效果,定量PCR分析靶质粒清除效率,菌落计数法统计耐药细菌的敏感化率。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体介入细菌耐药质粒的转化、接合等水平转移途径,评价噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒在阻断细菌耐药性传播扩散方面的效果。建立温和噬菌体递呈CRISPR-Cas9联合抗生素的抗耐药菌策略,在包括生物膜、小鼠皮肤感染模型、小鼠肠道感染模型等体内外条件下检验该策略的耐药性清除及耐药菌杀灭效力。对联合抗耐药菌策略的杀菌效力进行至少1周时间内的连续监测,观察是否会出现细菌对该策略的耐受突变,并和烈性噬菌体直接杀菌策略的耐受突变相比较。采用全基因组测序分析细菌产生噬菌体耐受突变的机制。研究结果:(1)建立了针对bla_(NDM-1)基因的CRISPR-Cas9系统靶点文库,包含20条特异性spacer序列。构建了靶向剪切bla_(NDM-1)基因的特异性原核CRISPR-Cas9系统质粒。(2)利用CRISPR-Cas9系统清除大肠杆菌的NDM-1质粒,使产NDM-1耐药模式菌变为bla_(NDM-1)阴性,恢复细菌对亚胺培南及其它β-内酰胺类抗生素的敏感性。(3)证明原核CRISPR-Cas9质粒转化耐药菌可以高效清除大肠杆菌中携带的NDM-1质粒。证明无论是天然的NDM-1大质粒还是重组NDM-1高拷贝质粒均可以在12 h内实现大于99%的细胞内清除率。(4)建立了新的噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,首次探索完成了大肠杆菌温和噬菌体从分离测序到“一步法”包装CRISPR-Cas9系统的整套技术流程。(5)检验了噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统在体外条件下清除靶质粒的效率,发现在8小时内能实现大于99%的耐药质粒清除率。提出利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性联合抗生素杀死耐药菌的策略,在体外实验中降低了约10~6倍的耐药大肠杆菌数量,优于已报道研究中所采用的细菌染色体靶向策略。(6)噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术能够减少细菌耐药质粒在环境中的释放和积累,相比烈性噬菌体在8小时内减少了约98.7%的耐药质粒释放。噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术可阻断耐药质粒在细菌间的接合转移,减少了98%的pNDM-1接合子菌落数量,抑制细菌耐药性的传播扩散。(7)首次在形成生物膜的耐药菌中评价噬菌体递呈CRISPR系统技术,并证明该技术能够在成熟生物膜中清除约50%的耐药质粒,将抗生素的最低生物膜清除浓度降低50%。(8)首次在体内实验中评价CRISPR靶向细菌耐药质粒的策略,噬菌体递呈CRISPR系统能够在小鼠皮肤感染模型和小鼠肠道感染模型中发挥清除细菌耐药质粒的作用并联合抗生素实现10~5~10~6倍的耐药大肠杆菌数的降低,效果优于已报道的CRISPR靶向细菌染色体策略。(9)在体外条件下进行长时间杀菌效果监测,烈性噬菌体杀菌策略在24小时内快速引发细菌的噬菌体耐受现象。而192小时内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的新耐受现象。体内条件下,在小鼠皮肤和肠道耐药菌感染模型中持续监测该策略,烈性噬菌体策略在2-3天内出现细菌的耐受,而7天内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的耐受。(10)通过对耐受突变株的全基因组测序,揭示大肠杆菌MG1655形成烈性噬菌体vB_253耐受的机制是在fepA基因位点出现碱基突变;大肠杆菌MG1655形成卡那霉素耐受的机制是在fusA基因位点出现碱基突变。而噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒联合抗生素杀菌的策略不会导致细菌出现上述基因突变。研究结论:本研究提出了利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的策略。在方法学上新建了温和噬菌体“一步法”包装CRISPR-Cas9系统技术。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统高效靶向清除细菌耐药质粒的策略,破坏了介导细菌耐药性的质粒,阻断细菌耐药性的传播,降低菌群环境中的耐药基因水平,具备开发成为细菌耐药性防控新技术的潜力。在耐药菌治疗方面,噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性并联合应用抗生素在体内外一系列实验中实现了强大的杀灭耐药菌能力。该策略不仅解决了由耐药基因介导的细菌耐药性问题,使失效的抗生素疗法重新焕发生机,还避免了杀菌过程中可能出现的耐受突变,有望成为一种有效杀灭耐药菌的新方法,在抗耐药菌领域有巨大的应用潜力。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378
【图文】：

在不同菌株和菌种间传播。以介导耐受碳该基因在 2010 年被首次报道发现，同年的不动杆菌，并发现该基因定位于可移现，产 NDM-1 菌在我国医院临床、环境位于可移动质粒，并且涉及了多种质粒类药基因的跨菌种快速传播。因此，清除细性，又可以破坏耐药基因的传播载体，进菌的治疗和防控。术的发展为研究人员提供了高效便捷的基领域也得到了广泛应用[33]。利用 CRISP细菌基因位点，并使 DNA 发生双链断裂断裂的 DNA 双链在细菌细胞内核酸酶的们的研究将 CRISPR-Cas9 系统设定为靶向耐受碳青酶烯类抗生素的 NDM-1 质粒[34药菌的敏感化，见图 1.1。

军事科学院博士学位论文中 blaNDM-1和 cas9 基因。见图 1.1 a，每个质粒挑选 个转化菌落作展示，粒的转化子中均检测不到 blaNDM-1基因。挑选pCas9-T1质粒进 步分析清除pNDM-1的细菌占总细菌比例，并以pC粒载体转化组对照。分别从转化了 pCas9-T1 的实验组平板和转化 pCas9 空照组的平板上挑选 15 个单菌落，blaNDM-1基因的阳性情况如图 1.1 所示：实15 个菌落全部呈 blaNDM-1阴性，表明经 Cas9 核酸酶的特异性剪切后，该基因 PCR 扩增。在挑选的 15 个转化子中剪切成功率为 100%。而对照组 Cas9缺少 gRNA 的引导作用，未对 blaNDM-1 进行特异性切割。采用三对引NDM-F/NDM-R，NDM(Sal)-F/NDM(Xba)-R，NDM3-F/NDM3-R）再次验as9-T1 实验组中大肠杆菌单菌落携带 blaNDM-1 情况，PCR 结果均表明特异ISPR 系统能够剪切破坏 blaNDM-1基因。

第 22 页图 1.3 J53 模式菌耐药表型的转变a：Etest 试纸条检测金属酶表达情况b：Etest 试纸条检测亚胺培南 MIC 值c：亚胺培南 MIC 值统计分析1.3.4 CRISPR 系统剪切清除 pNDM-1 效率的分析对耐药质粒的清除效率关系到 CRISPR-Cas9 系统清除耐药质粒技术的实性，也能给细菌敏感化后的抗生素联用时机提供参考。本研究深入分析了 pCas9-T清除 J53 细胞内 pNDM-1 的效率。采用定量 PCR（quantitative PCR，qPCR）的法，以 16S 基因为内参，计算转化 CRISPR-Cas9 系统后第 2、4、8、16 和 32 小等时间点上 pNDM-1 拷贝量的变化，见图 1.3。定量分析发现，CRISPR 系统清pNDM-1 速度极快，在 2 小时即清除了约 50%的耐药质粒，在 8 小时即实现了于 99.9%的清除效率，并且耐药质粒的清除作用 直持续到第 32 小时。虽pNDM-1 质粒有潜在的恢复自身拷贝的可能，但经本实验证实 CRISPR 清

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本文编号：2800717