人脂肪干细胞外泌体中microRNA-19b-3p的抑炎作用及对急性肝衰竭动物模型治疗的探索
发布时间：2020-08-24 16:04
【摘要】：目的:课题组前期通过高通量测序发现人脂肪干细胞(human adipose stem cells,hASCs)来源外泌体对急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)大鼠肝组织内炎症及趋化相关信号通路具有一定的抑制作用,本研究拟探索外泌体内高表达的具有抑炎作用的miRNA治疗ALF大鼠的可能机制。方法:1、通过共聚焦显微镜、ELISA及流式细胞术等检测外泌体内高表达的具有抑炎作用的miRNA对D-氨基半乳糖盐酸盐(D-gal)联合脂多糖(LPS)活化的巨噬细胞释放活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、炎症因子(IL-1α、IL-6及TNF-α)及细胞凋亡率的影响,筛选出抑炎作用最强的miRNA。2、分别使用外泌体或过表达抑炎作用最强的miRNA外泌体治疗D-gal/LPS诱导的ALF大鼠,或过表达抑炎作用最强的miRNA的慢病毒预处理大鼠并使用D-gal/LPS诱导其发生ALF,观察大鼠生存率、肝功能及肝组织内“P47phox-ROS-炎症因子(IL-10、IL-1α、IL-6、TNF-α)”通路的变化。结果:外泌体内高表达的六种具有抑炎作用的miRNA中,miR-19b-3p对活化巨噬细胞的抑炎作用最强,游离形式或外泌体形式miR-19b-3p可显著抑制活化巨噬细胞内P47phox、ROS及炎症促进性细胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α的表达,同时促进炎症抑制性细胞因子IL-10的表达。过表达miR-19b-3p外泌体治疗或过表达miR-19b-3p慢病毒预处理显著改善急性肝衰竭大鼠一般情况,24h生存率及肝组织组织病理变化,限制抑制肝组织内P47phox、ROS及多种炎症因子及趋化因子表达。结论:过表达miR-19b-3p的外泌体可通过抑制活化巨噬细胞或ALF大鼠肝组织内“P47phox-ROS”通路抑制炎症因子及趋化因子表达减轻肝组织炎症性损伤,从而提高ALF大鼠的生存率。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.3;R-332
【图文】：
5ul FITC Annexin V 及 5ul PI。轻轻旋涡混匀，室温避光孵育 15 分钟。每管中加入 400ul 1X Binding Buffer，流式细胞仪上机检测。1.3 统计学分析本课题的实验数据均应用 SPSS 21.0 软件进行分析并以均数±标准误(mean±SEM)表示，用 ANOVA 统计多组间差别，P<0.05 为差异有统计学意义。2. 结果2.1 六种 miRNA 在活化巨噬细胞内可检测性如图 1-1 所示，外泌体内高表达的抑炎相关六种 miRNA 中，miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p 在活化巨噬细胞内可被检测出，而 miR-214-3p、miR-193b-3p 及 miR-29a-3p 均未检出，推测活化巨噬细胞内 miR-214-3p、miR193b-3p 及 miR-29a-3p 表达量极低，在后续的检测中将仅针对 miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p。
图 2-3 共聚焦显微镜检测各组巨噬细胞内 ROS 表达Fig. 2-3 ROS expression in macrophages in each group detected by confocal microscopy.4 ELISA 检测细胞培养上清炎症细胞因子的表达如图所示，D-gal/LPS 活化巨噬细胞后，细胞内炎症性细胞因子 IL-1α、IL TNF-α表达量增加，细胞发生炎症性损伤。miR-19b-3p mimic 转染显著减低化巨噬细胞内 IL-1α的表达（P＜0.05），TNF-α有所下降，但与阳性对照组比无明显差异性，与 miR-19b-3p mimic 组相比，inhibitor 转染组活化巨噬细胞-1α、TNF-α及 IL-6 的表达均增加，其中 IL-6 具有显著差异性（P＜0.01）明 miR-19b-3p 可抑制活化巨噬细胞内炎症促进性细胞因子的表达，减少炎症损伤。与 miR-24-3p inhibitor 组相比，活化巨噬细胞 miR-24-3p mimic 转染组-1α及 TNF-α的表达均增加，IL-6 的表达虽较 inhibitor 转染组低，但两者的达均较阳性对照组高，说明 miR-24-3p 可促进活化巨噬细胞释放炎症细胞因，加重炎症性损伤。活化巨噬细胞转染 miR-221-3p mimic 后 TNF-α的表达受
图 2-5 流式细胞术检测三种 miRNAs 对活化巨噬细胞凋亡的影响Fig.2-5 The influence of three miRNAs on the apoptosis of activated macrophages wasdetected by flow表 2-1 各组 miRNA 对活化巨噬凋亡率数据统计表Tab. 2-1 The statistical data of activated macrophages apoptosis rate treated with differenmiRNA实验分组 细胞存活率 早期凋亡 晚期凋亡 死亡率NC 85.8% 8.46% 2.41% 2.31%PC 73.7% 20.8% 3.58% 1.93%MiR-19b-3p mimic 77% 15% 4.84% 3.17%MiR-19b-3p inhibitor 9.31% 62.1% 25.6% 2.9%MiR-24-3p mimic 8.04% 64.2% 26.3% 1.52%MiR-24-3p inhibitor 29.8% 62.7% 5.41% 2.17%MiR-221-3p mimic 23.2% 71.2% 5.16% 0.426%MiR-221-3p inhibitor 5.16% 72.6% 20.5% 1.52%
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.3;R-332
【图文】：
5ul FITC Annexin V 及 5ul PI。轻轻旋涡混匀，室温避光孵育 15 分钟。每管中加入 400ul 1X Binding Buffer，流式细胞仪上机检测。1.3 统计学分析本课题的实验数据均应用 SPSS 21.0 软件进行分析并以均数±标准误(mean±SEM)表示，用 ANOVA 统计多组间差别，P<0.05 为差异有统计学意义。2. 结果2.1 六种 miRNA 在活化巨噬细胞内可检测性如图 1-1 所示，外泌体内高表达的抑炎相关六种 miRNA 中，miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p 在活化巨噬细胞内可被检测出，而 miR-214-3p、miR-193b-3p 及 miR-29a-3p 均未检出，推测活化巨噬细胞内 miR-214-3p、miR193b-3p 及 miR-29a-3p 表达量极低，在后续的检测中将仅针对 miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p。
图 2-3 共聚焦显微镜检测各组巨噬细胞内 ROS 表达Fig. 2-3 ROS expression in macrophages in each group detected by confocal microscopy.4 ELISA 检测细胞培养上清炎症细胞因子的表达如图所示，D-gal/LPS 活化巨噬细胞后，细胞内炎症性细胞因子 IL-1α、IL TNF-α表达量增加，细胞发生炎症性损伤。miR-19b-3p mimic 转染显著减低化巨噬细胞内 IL-1α的表达（P＜0.05），TNF-α有所下降，但与阳性对照组比无明显差异性，与 miR-19b-3p mimic 组相比，inhibitor 转染组活化巨噬细胞-1α、TNF-α及 IL-6 的表达均增加，其中 IL-6 具有显著差异性（P＜0.01）明 miR-19b-3p 可抑制活化巨噬细胞内炎症促进性细胞因子的表达，减少炎症损伤。与 miR-24-3p inhibitor 组相比，活化巨噬细胞 miR-24-3p mimic 转染组-1α及 TNF-α的表达均增加，IL-6 的表达虽较 inhibitor 转染组低，但两者的达均较阳性对照组高，说明 miR-24-3p 可促进活化巨噬细胞释放炎症细胞因，加重炎症性损伤。活化巨噬细胞转染 miR-221-3p mimic 后 TNF-α的表达受
图 2-5 流式细胞术检测三种 miRNAs 对活化巨噬细胞凋亡的影响Fig.2-5 The influence of three miRNAs on the apoptosis of activated macrophages wasdetected by flow表 2-1 各组 miRNA 对活化巨噬凋亡率数据统计表Tab. 2-1 The statistical data of activated macrophages apoptosis rate treated with differenmiRNA实验分组 细胞存活率 早期凋亡 晚期凋亡 死亡率NC 85.8% 8.46% 2.41% 2.31%PC 73.7% 20.8% 3.58% 1.93%MiR-19b-3p mimic 77% 15% 4.84% 3.17%MiR-19b-3p inhibitor 9.31% 62.1% 25.6% 2.9%MiR-24-3p mimic 8.04% 64.2% 26.3% 1.52%MiR-24-3p inhibitor 29.8% 62.7% 5.41% 2.17%MiR-221-3p mimic 23.2% 71.2% 5.16% 0.426%MiR-221-3p inhibitor 5.16% 72.6% 20.5% 1.52%
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本文编号：2802665
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