前交叉韧带重建术后膝骨关节炎小型猪模型的建立及其发病机制的研究

发布时间：2020-08-24 19:49

【摘要】：研究背景:骨关节炎(osteoarthritis,OA)是关节骨科常见的一种疾病,近年来随着交通事故和运动创伤发生率的不断增高,前交叉韧带(anterior cruciate ligaments,ACL)损伤继而引发创伤性骨关节炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)的发病率也逐年增高,致使OA发病率居高不下的同时出现了发病年龄逐渐年轻化的趋势。目前已知在未经治疗的ACL损伤的膝关节中,会继发关节半月板和软骨退变,并最终出现创伤性骨关节炎。而经过ACL重建手术(作为ACL损伤患者最常用的治疗方式之一)治疗的患者,长期随访发现虽然手术恢复了膝关节的稳定性,但是仍有相当一部分患者最终发展为创伤性骨关节炎。这种已恢复稳定的膝关节发生OA的病理机制尚未明确。目的:本课题研究旨在通过建立ACL重建术后膝关节OA动物模型,观察ACL重建术后继发的半月板,软骨及软骨下骨等膝关节组织学退变,同时检测动物模型膝关节滑液中炎症因子及相关蛋白表达丰度,验证关节内炎症可能参与早期OA发生这一假设。与此同时,为了深入挖掘ACL重建相关OA的发病机制,我们拟通过关节软骨蛋白质组学方法筛选炎症相关的表达差异蛋白,并从中选一特定蛋白进行体外实验,以期发现其对软骨细胞凋亡的影响。方法:1.获取小型猪、羊(两种最常见临床前动物模型物种)正常膝关节MicroCT扫描断层图像数据,使用Mimics、Geomagic Studio 2014、Pro/Engineer、Nastran等软件建立膝关节三维几何模型,并在验证模型有效性的同时,通过屈膝30°和屈膝60°两种ACL最易损伤状态下的三维有限元应力载荷分析,对比小型猪和羊膝关节间的生物力学差异。从力学角度尝试寻找适宜模拟人体ACL重建手术的临床前动物模型。2.使用ACL自体原位移植法建立OA小型猪模型,并验证该模型的时效性和稳定性。使用形态学评分法,从早期骨赘形成、关节软骨和半月板损伤三方面行小型猪膝关节OA改变的定量评估。利用印度墨汁染色、番红O固绿染色等技术定性观察膝关节OA组织学改变程度及趋势。选取ACL重建术后1月、术后2月、术后3月和术后4月4个时间点,获取膝关节软骨组织。用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)方法定量软骨组织中信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表达情况,并抽取小型猪膝关节滑液用Luminex悬液芯片技术定量炎症因子表达丰度。最后利用多元线性回归模型分析炎症因子与ACL重建术后关节OA组织学变化的相关性。3.采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记定量蛋白质组学方法,通过同位素标签特异性地标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,而后进行串联质谱分析,比较OA小型猪模型软骨组织中差异蛋白的相对含量。筛选出表达差异蛋白质后,利用蛋白质序列聚类分析、基因功能(gene ontology,GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析以及蛋白互作网络分析(protein-protein interaction network,PPI network)等生物信息学方法,对筛选出的差异表达蛋白质进行功能注释及代谢或信号通路预测。4.在表达差异蛋白质中选定与炎症反应密切相关的膜联蛋白A1(annexin A1,ANXA1)作为靶标蛋白,通过免疫组化染色和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)验证ANXA1蛋白在不同阶段人膝关节OA组织标本中的表达变化。同时体外培养白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导出现炎症损伤反应(类OA改变)的小鼠肋软骨细胞,通过脂质体转染含有ANXA1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,从而人为敲减ANXA1基因的内源性表达,观察其对软骨细胞凋亡的影响。结果1.经过三维有限元生物力学分析,对比了小型猪、羊膝关节在屈膝30°和屈膝60°弯矩荷载作用下关节内各组织结构的应力差异。总体而言,无论是小型猪还是羊,其膝关节各结构的组织应力,均随着屈膝角度的增加而增大。但是,在相同屈膝角度下,羊膝关节各组织结构的应力峰值(屈膝30°:12.5MPa-30.4MPa;屈膝60°:17.9MPa-43.5MPa)整体要大于小型猪(屈膝30°:11.1MPa-20.2MPa;屈膝60°:15.9MPa-28.9MPa),且周围韧带中应力载荷的分布不均匀。其中羊的前交叉韧带和内侧副韧带的应力要比后交叉韧带及外侧副韧带大很多。相反地,小型猪膝关节对应的软骨、半月板及各周围韧带的应力值和变化规律则更接近于人体。2.⑴成功建立了ACL重建术后OA小型猪模型,并且通过印度墨汁染色、番红O固绿染色等技术观察到膝关节OA组织学改变出现在ACL重建术后3月时,证明该模型具有良好的时效性和可靠性。⑵在ACL重建组(idealized ACL reconstruction,IACLR)中观察到显著的以骨赘形成为主的OA组织学改变,并且伴有基质金属蛋白酶-1,13(matrix metalloproteinase-1,13,MMP-1,13)mRNA表达水平的增高和聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)mRNA及蛋白质表达水平的降低。从而导致了IACLR组大体形态学评分显著高于空白对照组。此外,IACLR组动物膝关节滑液中炎症因子(如:IL-1β,4,6和肿瘤坏死因子tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达显著增加。最重要的是,通过多元线性回归模型分析发现IL-1β,6和TNF-α浓度与OA形态学评分之间存在显著相关性(其中重建手术组统计结果显示:IL-1β,6和TNF-α其P值分别为0.023,0.006和0.001。而空白对照组也得到了IL-1β,6和TNF-α具有预测意义的统计结果,其P值分别为0.001,0.017和0.001)。3.采用TMT定量蛋白质组学技术,在OA小型猪(Sus Scrofa科)模型软骨组织中共鉴定到蛋白质2950个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83)且P0.05的标准筛选出差异表达蛋白质491个。其中,OA软骨组织较正常软骨组织上调的差异表达蛋白质有198个,下调的差异表达蛋白质293个。经过GO功能和KEGG通路富集分析发现,这些差异表达蛋白质的功能主要是结合(binding)、催化活性(catalytic activity),结构分子活性(structural molecule activity)、转运活性(transporter activity)和分子功能调控(molecular function regulator)等。这些差异表达蛋白质主要参与了细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic结果:process)、生物调控(biological regulation)、生物过程调控(regulation of biological process)和细胞组分组织或合成(cellular component organization or biogenesis)等重要生物学过程。4.⑴选择差异表达蛋白质ANXA1为靶标蛋白,并通过免疫组化染色和ELISA检测法,发现其在人膝关节OA不同阶段软骨组织标本和关节滑液标本中均有一定程度的表达,且存在着早期及中期OA标本中表达降低,而晚期OA则表达增高的规律。⑵经过IL-1β试剂干预后诱导的炎症损伤,小鼠肋软骨细胞出现了类似OA软骨细胞损伤的状态。我们通过脂质体转染技术人为敲减ANXA1基因在软骨细胞中的表达后,通过流式细胞术观察到了软骨细胞早期凋亡减少的现象。结论:通过三维有限元分析,我们发现小型猪在模拟人膝关节屈膝状态下应力载荷分布等方面更具优势。利用小型猪建立的ACL重建术后OA模型具有良好的稳定性和时效性,并且通过该动物模型研究表明炎症参与了此类OA的发病过程。采用TMT标记的蛋白质组学方法,在小型猪OA软骨组织中筛选出491个表达差异蛋白质。其中,选定与炎症密切相关的ANXA1蛋白作为新靶标,在人体不同阶段OA组织标本中得到了表达验证。最后在体外实验中,我们发现ANXA1蛋白具有促进软骨细胞凋亡的作用。当然,其发挥调控作用的分子机制还需进一步研究来证实。本课题为国家国际科技合作专项“α2巨球蛋白诊断及治疗骨关节炎的合作研究(编号:2015DFA33050)”。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R687.4;R-332
【图文】：

示意图,小型猪,膝关节,三维重建

山西医科大学博士学位论文lding”命令，设置相应灰度阈值区间，提取小型猪、羊膝关节等用软件的擦除充填和自提取功能，对模型中的破洞、伪影和噪音高组织结构的影像质量。最终得到小型猪、羊膝关节的粗糙几何TL 格式文件。用 Geomagic Studio 2014 软件对 STL 格式文件进行细分降噪和过精确曲面等过程对其进行曲面拟合，最终得到完整小型猪、羊的三维实体模型，并保存为.STP 格式文件。具体的三维重建几何 1-2 所示。

示意图,标准品,悬液,芯片

图 2-3 悬液芯片标准品稀释示意图.2 样品准备：（冰上操作）小型猪膝关节滑液样本：10000rpm 离心 10min，取上清。离心后样本原液检测。.3 样品孵育：①按照说明书要求，用去离子水重悬标准品、质控品。轻轻混匀，放置于min，以保证其充分溶解。②用缓冲液对标准品进行稀释，实验共计稀释 7 个梯度，S1-S7。③用 LA-BD微珠稀释液按照说明书要求稀释微珠，1400rpm 振荡 30s，每孔量加入 96 孔板中。④加入稀释好的标准品、对照 1、对照 2、空白对照和样品，每孔 25μl，品孔中每孔加 25μl 缓冲液，标准品、对照 1、对照 2、空白对照孔每孔加 25液，贴上封口膜，放置在平板摇床上 850rpm 振荡避光 4℃过夜孵育。

和同,试剂,位置,炎症因子

图 3-1 TMT 试剂结构（6 标）和同位素位置（*）研究中，我们发现炎症因子（IL-1β、IL-6 和 TNF后 OA 的发病过程，那么究竟这些炎症因子如何参接受哪些代谢或信号通路的调节呢？为了深入挖掘下来的第三部分研究中，我们依据蛋白质组学的理分析技术，在 OA 小型猪膝关节软骨组织中筛查并尤其是可能与炎症调控相关的差异蛋白。同时，利富集分析等生物信息学方法，研究这些差异蛋白质在学功能及参与的通路途经。

【参考文献】