基于LC-MS尿液代谢组学的模拟微重力诱导抑郁大鼠模型及黄花菜抗抑郁作用研究

发布时间：2020-08-24 21:53

【摘要】：抑郁是以长久情绪低落为主要表现的精神功能障碍,严重影响人们的生活质量和水平。代谢组学可以同时监测多种代谢物和代谢途径的变化,以探索抑郁症的病理机制及其代谢调控。本研究通过尾部悬吊后肢去负荷法建立模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)大鼠抑郁模型;基于超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)技术研究抑郁大鼠模型尿液代谢谱,识别与抑郁相关的潜在代谢生物标记物;基于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)方法,对鉴定出的差异性代谢物进行靶向有效验证,阐明模拟微重力对大鼠的代谢通路影响。前人研究发现,黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni,HC)及其提取物(Hemerocallis citrina Extracts,HCE)具有显著的抗抑郁作用,且机制复杂,仍需进一步研究。本文通过建立SMG大鼠抑郁模型,以黄花菜提取物加以干预,开展HCE干预抑郁大鼠尿液的代谢组学研究,探索其抗抑郁的差异性代谢物质及调控机制。本文的主要研究内容和结果如下:1.模拟微重力大鼠抑郁模型(SMG)的建立及采用HCE进行干预。通过尾部悬吊后肢去负荷法建立SMG大鼠抑郁模型,以黄花菜醇提取物(HCE)加以干预,对空白组、模型组、HCE给药组及阳性组大鼠进行尿液样品采集。2.建立了UPLC-QTOF-MS尿液样品分析方法。尿液样本采集后首先进行样品预处理的优化;之后对液相色谱的进样体积、柱温、液相洗脱梯度以及锥孔电压、毛细管电压等质谱条件进行优化;同时通过对样品稳定性以及分析方法的精密度、重现性进行方法学考察,建立针对尿液样品的最优分析方法。3.基于UPLC-QTOF-MS非靶向代谢组学模拟微重力诱导抑郁大鼠模型及HCE抗抑郁作用的研究。采用UPLC-QTOF-MS方法对各组大鼠的尿液样品分别进行分析。通过waters配套代谢组学软件Progenesis QI及其嵌套软件Ezinfo进行数据处理和多元统计分析,获得差异性代谢物,并结合数据库等信息进行结构鉴定。结果发现,模型组大鼠尿液的代谢轮廓发生了显著改变,正常组和模型组比较鉴定出22种差异代谢物;而口服HCE显著改变了抑郁大鼠的代谢轮廓,模型组与给药组之间鉴定到16种代谢物的水平发生改变;阳性药帕罗西汀同样使抑郁大鼠的代谢轮廓发生显著改变,阳性药和HCE改善抑郁的标志性代谢物不同,因此推测两者发挥抗抑郁的作用机制可能有所不同。4.UPLC-QQQ-MS/MS靶向代谢组学模拟微重力诱导抑郁大鼠模型及HCE抗抑郁作用的研究。通过UPLC-QQQ-MS/MS分析方法,对鉴定得到的差异性代谢物的标准品建立标准曲线来进行定量测定和验证,将鉴定到的生物标记物峰面积进行归一化比较,之后采用热图、代谢通路等方法进行分析并阐述其生物学意义。与空白组比较,模型组抑郁大鼠尿液中15个生物标记物经SPSS统计分析后差异显著;受到影响与抑郁相关的代谢通路主要包括神经递质生物合成、氨基酸、能量代谢等。而HCE干预后,有显著性差异的生物标记物有16个;HCE干预受到影响且和抑郁相关的通路有色氨酸代谢通路、谷氨酸代谢通路、苯丙酸代谢通路和能量代谢通路等。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.4;R-332
【图文】：

大鼠,灌胃给药,蒸馏水,模拟微重力

应激造模 14d。具体各组动物给药剂量见下表 2.1。表 2.1 动物分组及给药剂量Table 2.1 Animal Grouping and Dosage组别Groups剂量Dosage浓度concentration给药体积Dosing volume给药途径Route ofadministratio（g/mL）（mL/100g）完全空白组蒸馏水蒸馏水 1 灌胃给药尾吊模型组蒸馏水蒸馏水 1 灌胃给药帕罗西汀组 10 mg/kg·d 0.001 1 灌胃给药黄花菜总提取物给药组 3.97 g/kg·d 0.397 1 灌胃给药2.4.2 模拟微重力大鼠模型的建立模拟微重力（SMG）程序采用了（Kim et al, 2014）报道的方法，稍作修改。简而言之，对照大鼠饲养在同一笼内，而 SMG 处理的大鼠在整个实验中使用特定的尾部悬吊装置，单独安置。清洗处理大鼠尾部表面，尾根部和尾尖部以环装胶带加固并固定金属钩，与尾吊笼顶端的金属环以金属链相连，可通过金属钩的高度悬吊大鼠后肢，大鼠通过前肢可在笼中自由活动和饮水（如图 2.1）。造模流程如下图所示 2.2。

流程图,流程图,尾部悬吊,尿液

图 2.2 造模流程图Figure 2.2 Model Establishment Flow Chart2.4.3 尿液样品采集模型建立结束，禁食不禁水 12 h 后，大鼠放置在代谢笼内 12 h 采集并记录尿液体积，每个采尿管中提前加入 2 mL5% 叠氮化钠生理盐水溶液（以防止尿液染菌）。收集到的尿液迅速在 4℃下离心（7607 r·min- 1，15min），上清液进行分装后保存在 80°C 冰箱备用。2.5 实验讨论目前，基于地面的 SMG 模型如头低位 6°卧床（Kelsen et al, 2012）和动物尾部悬吊后肢（Swifet al, 2010）方法，因基于地面的研究成本较低，可不受飞行时间限制，便于改动研究方案。且实验操作性较为方便，也可据实验进展和结果灵活改变时间长短。便于采集各种组织和体液样品。依旧是探索 SMG 对生物体影响常用的模型。尾部悬吊后肢法是模拟 SMG 主要使用的一种方法，研究表明，尾部悬吊后肢能有效的模拟微重力状态下生物体生理生化改变。头低位 6°卧床法能导致体液向头向转移，使心血管系统的静压力显著降低，同时减少重力负荷对心血管系统的影响。

色谱图,超纯水,高速离心,乙腈

G2-XS 系统的 QTOF 分析仪获得质谱正负离子数据，根据小分子代谢物的定最佳质谱参数。精密度理后的尿液样品，采用优化的 UPLC-QTOF-MS 分析方法重复进样 6 次，峰，计算 6 次进样的色谱峰 m/z 和保留时间的 RSD%。重复性理后的尿液样品，平行制备 6 份，采用优化的 UPLC-QTOF-MS 分析方法 6 个色谱峰，计算 6 次进的样色谱峰 m/z 和保留时间的 RSD%处理方法优化处理好的尿液样品，分别以 4℃超纯水、乙腈和甲醇相同体积稀释处理，其色谱图如下图，由图可见，用甲醇处理的尿液样品的色谱峰数、强度和

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