牛早期雄性与雌性胚胎增殖分化差异研究

发布时间：2017-04-01 11:03

  本文关键词：牛早期雄性与雌性胚胎增殖分化差异研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文为确定牛早期两性胚胎在增殖分化方面的差异,对牛早期雄性及雌性胚胎细胞数、线粒体DNA拷贝数及端粒长度进行检测,建立牛早期胚胎线粒体DNA拷贝数及端粒长度检测方法并为两性胚胎增殖分化差异研究提供理论依据。1.使用本室保存的30枚雄性牛囊胚期性控胚胎及30枚牛雌性囊胚期性控胚胎做为实验材料,抽取3枚雄性胚胎及3枚雌性胚胎验证性别可靠程度,经牙釉质基因扩增验证准确率为100%,对剩余27枚雄性及27枚雌性胚胎进行检测。将胚胎解冻后除去透明带,使用TritonX-100处理胚胎以增加胚胎细胞膜通透性,碘化丙啶染色后在荧光显微镜下拍照,分别对雌性及雄性胚胎细胞计数,雄性胚胎细胞数为131.10±9.37高于雌性囊胚期胚胎细胞数的116.90±7.45,差异极显著(P0.01)。2.利用超数排卵技术获得56枚可用囊胚作为实验材料,提取的胚胎DNA分为三部分,分别用于性别鉴定、线粒体DNA拷贝数检测以及端粒长度检测。使用牙釉质基因巢式扩增PCR鉴定性别,29枚为雄性,27枚为雌性。从牛静脉血基因组DNA扩增线粒体DNA单拷贝基因cox1(190bp),将目的基因克隆至pMD19-T载体以构建重组质粒,提取质粒DNA计算拷贝数,稀释至拷贝数为108-103作为标准品制作标准曲线,采用荧光定量PCR法检测雄性及雌性胚胎线粒体DNA拷贝数。结果:建立了实时荧光定量PCR检测牛囊胚期胚胎线粒体DNA拷贝数的方法;雄性囊胚期胚胎线粒体DNA拷贝数为897223±76723,雌性囊胚期胚胎线粒体拷贝数为693452±45236,牛囊胚期雄性胚胎线粒体DNA拷贝数极显著高于雌性胚胎(P0.01)。3.对29枚雄性胚胎和27枚雌性胚胎采用实时荧光定量方法测定两性胚胎相对端粒长度,通过使用特异性引物对端粒(T)及单拷贝基因H2a.z(S)定量,计算telomere/H2a.z比率(T/S),得到胚胎相对端粒长度。结果:建立了实时定量PCR检测牛早期胚胎端粒长度的方法;雄性囊胚期胚胎相对端粒长度为1.00±0.10,雌性囊胚期胚胎相对端粒长度为1.23±0.26,雌性胚胎相对端粒长度显著高于雄性胚胎(P0.05)。
【关键词】：牛 囊胚 细胞数 线粒体DNA 端粒长度
【学位授予单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第1章 文献综述8-21
• 1.1 哺乳动物早期胚胎发育8-12
• 1.1.1 哺乳动物早期胚胎发育8-9
• 1.1.2 雄性及雌性早期胚胎增殖分化差异9-10
• 1.1.3 胚胎质量评定10-12
• 1.2 线粒体与线粒体DNA12-15
• 1.2.1 线粒体结构与功能12
• 1.2.2 线粒体DNA的特点12-14
• 1.2.3 线粒体DNA与早期胚胎发育14-15
• 1.3 端粒与端粒酶15-19
• 1.3.1 端粒与端粒酶15-16
• 1.3.2 端粒长度测定方法16-19
• 1.4 研究目的及意义19-21
• 1.4.1 确定牛早期两性胚胎细胞数差异19
• 1.4.2 确定牛早期两性胚胎线粒体DNA拷贝数差异19-20
• 1.4.3 确定牛早期两性胚胎相对端粒长度差异20-21
• 第2章 牛雄性及雌性胚胎细胞数差异检测21-33
• 2.1 材料与方法21-27
• 2.1.1 实验材料21-22
• 2.1.2 实验方法22-27
• 2.1.3 统计分析27
• 2.2 结果与分析27-30
• 2.2.1 牙釉质基因引物验证27-28
• 2.2.2 性控胚胎抽样检测结果28-29
• 2.2.3 胚胎细胞数检测结果29-30
• 2.3 讨论30-32
• 2.4 小结32-33
• 第3章 牛雄性及雌性胚胎线粒体DNA拷贝数检测33-49
• 3.1 材料与方法33-41
• 3.1.1 实验材料33-35
• 3.1.2 实验方法35-41
• 3.2 结果与分析41-46
• 3.2.1 线粒体DNA cox1基因克隆结果41-44
• 3.2.2 胚胎性别鉴定结果44
• 3.2.3 胚胎线粒体DNA拷贝数检测结果44-46
• 3.3 讨论46-48
• 3.4 小结48-49
• 第4章 牛雄性及雌性囊胚端粒相对长度测定49-57
• 4.1 材料与方法49-51
• 4.1.1 实验材料49-50
• 4.1.2 实验方法50-51
• 4.2 结果与分析51-54
• 4.2.1 胚胎性别鉴定51-52
• 4.2.2 胚胎端粒长度检测52-54
• 4.3 讨论54-56
• 4.4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-69
• 致谢69-70
• 作者简介70

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本文编号：280486