低频脉冲电磁场对人脂肪源干细胞增殖及成骨分化的影响

发布时间：2020-08-28 06:16

【摘要】：研究背景:电磁场由相互依存的电场和磁场共同组成,其普遍存在于自然界和生物界,对生物学过程有着广泛的影响。在医学领域,运用脉冲电磁场治疗骨折延迟愈合和骨不连已有40多年的历史。低频脉冲电磁场(PEMF)可用于治疗骨不连、骨质疏松和骨关节疾病,促进骨折愈合,并且以其无创伤、无感染、治疗方便、副作用小等优点日益受到人们的关注与重视,而用其治疗骨质疏松患者,可有效提高骨矿密度。这些发现使脉冲电磁场促进成骨的特性得到了广泛认可。成骨是一个有着复杂调控机制的生物学过程,其包含了骨髓间充质干细胞(BMSCs)等前体细胞向成骨细胞的分化以及成骨细胞分泌骨基质并矿化后形成骨组织的过程。成骨细胞是成骨的直接功能细胞。研究表明,脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、骨基质合成、生长因子的合成和分泌等均具有正性刺激作用。然而与BMSCs相比,脂肪来源的干细胞(ASCs)具有一些更吸引人的临床应用特征,例如丰富的来源,可在脂肪抽吸物中提取干细胞;更快的生长周期;提取过程中受试者更少的不适和手术期间的发病率。ASCs可以分化为成骨细胞,肌细胞,软骨细胞和其他细胞类型。因此,ASCs是治疗PEMF的临床工作的良好替代方案。然而关于脉冲电磁场对于ASCs在成骨方面的作用的研究任存在欠缺。研究目的:本实验使用脂肪源干细胞作为研究促成骨细胞的体外研究模型,试图阐明以下问题:第一,PEMF能否促进ASCs脂肪源干细胞的增殖;第二,PEMF对ASCs脂肪源干细胞向成骨分化方面是否有作用;第三,PEMF对ASCs脂肪源干细胞向成骨分化具体作用。材料与方法:将人ASCs分为对照组(无PEMF暴露)和实验组(每天2小时进行PEMF照射暴露)。脉冲电磁场参数为场强1mT,频率50Hz,本实验研究中我们从几个方面检测了 PEMF对促进细胞增殖和成骨分化的影响:我们通过CCK-8细胞增殖试验证明PEMF对ASCs细胞增殖及凋亡有无影响;为了证明PEMF对对ASCs向成骨分化方面的影响,我们分别对实验组设置1周、2周、3周不同PEMF刺激时间,通过使用ALP染色检测成骨分化特殊指标碱性磷酸酶的表达,使用RNA提取和qRT-PCR实验方法分别对成骨表达特殊基因OPN(骨桥蛋白),OCN(骨钙蛋白),Runx-2(转录因子Runxx家族成员之一)的表达进行检测,并通过Western蛋白免疫印迹和免疫荧光染色实验对其相应成骨相关蛋白的表达进行检测。结果:首先,在PEMF的特异强度(1 mT)和频率(50 Hz)下,通过CCK-8细胞增殖检测实验表明,PEMF可以早期促进人ASCs的细胞增殖。其次,我们证明了PEMF可以促进脂肪源干细胞分化为成骨细胞。在ALP染色实验中,实验组中ASCs经过PEMF照射碱性磷酸酶表达量明显增加。在qRT-PCR实验中,特定PEMF暴露2周后实验组OPN,OCN,Runx-2成骨相关基因表达明显增加,通过Western印迹和免疫荧光染色测定,经过较长时间(3周)的PEMF处理后,相应成骨相关蛋白的表达也增加。结论:我们首次发现PMEF可在早期刺激hASCs的细胞增殖,随后促进骨相关基因表达和诱导相关蛋白的表达以刺激成骨分化。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

脉冲电磁场对于人脂肪间充质干细胞增殖的影响逡逑为了探索ＰＥＭＦ对细胞增殖的影响，使用ＣＣＫ－８测定来检测ｈＡＳＣ的增殖。逡逑如图１所示，我们可以通过ｃｃｋ－８实验直接观察细胞增殖的活性与数量。在实逡逑验时间点第１天，第３天，第５天和第７天实验组ｈＡＳＣｓ经过脉冲电磁场刺激逡逑后的吸光度０Ｄ值显着高于对照组（Ｐ＜0．邋０５），但在第１０天，第１３天的实验时逡逑间节点，实验组ｈＡＳＣｓ的ＯＤ值不再高于或低于对照组（Ｐ＞0．邋０５）。即脉冲电磁逡逑场刺激时间超过一周后，对于脂肪间充质干细胞的增殖影响不再明显。说明逡逑ＰＥＭＦ在一周内及一周左右的早期时间内促进了邋ｈＡＳＣｓ的细胞增殖，并可能对细逡逑胞增殖有积极作用。逡逑ＣＣＫ－８逡逑１＇５１逦．逦□邋ＰＥＭＦ逡逑Ｉ—Ｉ邋ａ邋Ｉ逦Ｉ１！？邋１＊１０逦ＥＳ３邋ＣＯＮＴＴＯＬ逡逑＊邋Ｉ邋ａ邋Ｓ邋：；逡逑１０－逦Ｔ逦Ｓ逦ｃ逡逑ａ邋Ｈ邋Ａ邋Ｓ邋Ｓ逡逑0邋（＊ｌ邋Ｉ逡逑°５－邋ｉ逦ｓ逦ｓ逦＆逦ｓ逡逑Ｓ：逦ｓ逦５逦？逦Ｓ逡逑0．0邋ＩＩ邋Ｉ，ｂｉ逦ｌｌ，ｉ：：ｌ逦ＩＩ．ＥＩ逡逑＾逦＾逦夕逡逑图１通过ＣＣＫ－８测定法分别在１天，４天，７天，１０天和１３天后测量实验组与对照组ｈＡＳＣ逡逑的生长情况。与对照组相比

从检测细胞蛋白表达水平出发，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ蛋白免疫印迹实验对其相应逡逑成骨相关蛋白的表达进行检测结果为：实验组和对照组在第７，邋１４和２１天进行逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验的结果显示在图３中。结果显示实验组与对照组细胞中ＯＰＮ逡逑和ＯＣＮ的蛋白表达在７天和１４天后没有显着变化。但实验组细胞经过ＰＲＭＦ暴逡逑露２１天后表达明显高于对照组。在经过７天的ＰＥＭＦ处理，实验组细胞ＲＵＮＸ－２逡逑的表达量与对照组无明显差异，但在第１４天和第２１天，实验组中Ｒｕｎｘ－２蛋白逡逑的表达显着高于对照组。逡逑１Ｗ邋１Ｗ邋２Ｗ邋２Ｗ邋３Ｗ邋３Ｗ逡逑ＯＣＮ逡逑ＰＥＭＦ邋＋＊逦＋逦＊■（■－逦＊逦ｉ—ｉ逡逑”逦ｉ逦ｆ邋口邋ＰＥＭＦ逡逑ｎ逦Ｅ３邋ＣＯＮＴＲＯＬ逡逑ＯＣＮ逦`e逡逑0ｐＮ邋ｍＫｍＩ逡逑ｉ邋0，邋１邋ｉ邋１逡逑柋逦逦邋４逦｜逦｜逡逑ＧＡＰＤＨ邋—0，0ｌ逡逑３ａ逦ｉ逦＾逦３ｂ逡逑ＲＵＮＸ－２逦ＯＰＮ逡逑￡２＇°１逦＊邋ｎ邋ＤＰＥＭＦ邋￡１，５１逦ＤＰＥＭＦ逡逑厂逦□邋ＣＯＮＴＲＯＬ逦Ｊ，邋ＥＣＯＭＴＯＬ逡逑（ｆ）邋＜邋１．５．逦这邋＜邋Ｔ逡逑Ｊ（５逦Ｘ逦￥０１０－邋Ａｍ邋ｍ］邋ｎｎ逡逑ａ？邋ｉ逦ａＳ逦ｉ逦Ｉ逦１逡逑ＩＵ邋Ｉ邋１逦１逦ｓｉ逦１逦１逦Ｉ逡逑■邋１１１１邋＼Ｉ１ＢＩ１ＩＩ逡逑令邋ｔ邋４邋３ｃ逦＾逦＾逦３ｄ逡逑Ｔｉｍｅ逦Ｔｉｍｅ逡逑图３：邋ＯＰＮ，邋ＯＣＮ，邋ＲＵＮＸ－２的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和实验组和对照组中ｌｗ，邋２ｗ和３ｗ的ｈＡＳＣ的半定逡逑量分析。图３ａ：邋ＯＰＮ

逑在通过免疫荧光检查细胞成骨蛋白的表达中，实验组和对照组在第７天，逡逑第１４天和第２１天的免疫荧光染色结果显示在图４中。实验组中ＲＵＮＸ－２的荧光逡逑强度在第１４天增加，并且在２１天的检测中显着高于对照组。在第２１天实验组逡逑细胞ＯＣＮ的表达高于对照组的表达，在早期第７天，第１４天两组无明显差异。逡逑然而，在视觉检查中，与对照组的表达相比，实验组中ＯＰＮ全程表达的增加趋逡逑势不明显。逡逑0ＰＮ逦ＣＯＮＴＲＯＬ逦ＰＥＭＦ逦0ＣＮ逦ＣＯＮＴＲＯＬ逦ＰＥＭＦ逡逑ＲＵＮＸ－２逦ＣＯＮＴＲＯＬ逦ＰＥＭＦ逡逑Ｈ邋ＨＩ逡逑３ｗＨＩＨ．逡逑图４实验组和对照组中１周，２周和３周的ＯＰＮ，邋ＯＣＮ，邋ＲＵＮＸ－２邋ｈＡＳＣ的ＩＦ染色。图４ａ：逡逑ＯＰＮ的ＩＦ染色。ｌｗ，邋２ｗ和３ｗ后ＯＰＮ蛋白表达无明显变化；４ｂ：邋ＯＣＮ的ＩＦ染色。实验组逡逑ＯＣＮ的表达在３ｗ时明显高于对照组，而两组之间ｌｗ和２ｗ无明显差异：４ｃ：邋ＲＵＮＸ－２的ＩＦ染逡逑色。在２ｗ和３ｗ时，实验组中Ｒｕｎｘ－２蛋白的表达显着高于对照组。逡逑Ｆｉｇ．邋４邋ＩＦ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＯＰＮ

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