线粒体分裂抑制剂1在急性肺损伤大鼠模型中的保护作用及机制

发布时间：2020-09-01 07:20

　　 [研究背景]:临床急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是ICU患者脓毒症后常见的并发症,与高发病率和高死亡率密切相关。由肺功能衰竭和多器官障碍导致的脓毒症,目前尚无有效可行的生物治疗措施。LPS是革兰氏阴性细菌的主要成分,在ALI的发展中起着重要作用。目前认为与脓毒症相关的多器官功能障碍可归因于病理化学和病理生理学损伤级联,包括炎症反应,自噬,线粒体功能障碍和细胞凋亡;此外,氧化应激也参与了ALI的发病机制。溶酶体通过自噬选择性降解去除功能失调的线粒体,这种自噬机制是一种称为线粒体自噬的过程。然而,线粒体自噬在疾病发展中的作用仍然存在争议。虽然一些研究已经证实过度的线粒体自噬会促进慢性阻塞性肺疾病的线粒体损伤,且过度的线粒体分裂与神经变性和线粒体病相关,但其在ALI中的作用仍然未知。使用线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)可阻断线粒体裂变,使未经过裂变的线粒体难以被吞噬细胞吞噬,从而达到抑制线粒体自噬的目的。先前的研究表明,过度的线粒体自噬可导致线粒体损伤,且Mdivi-1可以提供针对各种病理状况的保护作用。在本项研究中,我们假设线粒体自噬有助于ALI的进展,通过Mdivi-1的作用可抑制LPS诱导的线粒体自噬并减轻大鼠的肺损伤。[目的]:动物水平检测Mdivi-1对LPS诱导的ALI,线粒体自噬,细胞凋亡,氧化应激和炎症反应的影响,体外水平验证Mdivi-1对LPS诱导的线粒体功能障碍的保护作用,为ALI的损伤机制以及临床靶点药物治疗的研究提供线索。[方法]:1.动物实验:通过气管内滴注5mLLPS(10mg/kg)诱导大鼠ALI模型,使用随机数表将动物随机分成4组:空白对照组(0.5mLDMSO预处理60分钟,然后0.5mL生理盐水(NS)气管内滴注),Mdivi-1对照组(Mdivi-1(3mg/kg)溶于0.5mLDMSO尾静脉注射预处理60分钟,然后0.5mLNS气管内滴注),LPS组(0.5mLDMSO尾静脉注射预处理60分钟,然后LPS气管内滴注),Mdivi-1组(Mdivi-1(3mg/kg)溶于0.5mLDMSO尾静脉注射预处理60分钟,然后LPS气管内滴注);2.体外实验:10μg/mLLPS刺激A549细胞6小时以建立ALI细胞模型,使用随机数表将细胞随机分成4组:空白对照组(DMSO处理),Mdivi-1对照组(10μM Mdivi-1处理),LPS组(DMSO预处理60分钟,然后用LPS刺激细胞),Mdivi-1组(10μM Mdivi-1预处理60分钟,然后用LPS刺激细胞);3.通过HE染色,肺湿/干重比(W/D),氧合指数(PaO2/FiO2)和微血管通透性评估急性肺损伤的病理变化,并对损伤进行评分;通过蛋白质印迹评估线粒体相关蛋白的表达;JC-1荧光探针测量线粒体膜电位及分光光度计测量细胞内ATP水平反映线粒体功能变化;氧化应激由肺组织中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)和脂质过氧化物(LPO)的水平表示;大鼠肺组织Caspase-3活性水平通过荧光标记技术检测,TUNEL法检测肺组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax的表达。炎症因子(TNF-α,IL-1β和IL-6),髓过氧化物酶(MPO)活性和F4/80蛋白表达检测炎症反应水平。[结果]:1.大鼠动物模型中,LPS气管内滴注12小时后观察到明显的肺损伤和功能障碍,表现为组织病理改变,干/湿重比升高,氧合指数降低和肺微血管通透性增加,这与先前研究中报道的结果相似。中高剂量Mdivi-1预处理可显著改善LPS诱导的肺损伤;2.线粒体质量的变化反映线粒体自噬。通过免疫印迹法检测线粒体相关蛋白发现,ALI大鼠的TOM20和TIM23蛋白水平降低,提示线粒体质量减轻,即线粒体自噬活性被上调,而Mdivi-1预处理可抑制TOM20和TIM23蛋白表达下调。此外Mdivi-1预处理没有逆转LPS诱导的细胞自噬标志蛋白LC3 II/LC3 I比率增加和p62表达降低,且对线粒体生物合成标志蛋白PGC-1α和mt-TFA的表达也没有显著作用。这些结果表明Mdivi-1对线粒体生物合成和细胞自噬没有显著影响,进一步证明Mdivi-1通过调节线粒体自噬来影响线粒体质量。与此同时,在LPS诱导的体外模型中,A549细胞活性降低,线粒体膜电位(△Ψm)降低,细胞内ATP水平降低,提示线粒体功能障碍和细胞死亡,而Mdivi-1预处理改善了细胞线粒体损伤。3.ALI大鼠模型中,通过Mdivi-1预处理,肺组织LPO水平、MDA累积和SOD消耗增加均被逆转,提示氧化应激的改善;Mdivi-1抑制LPS诱导的细胞凋亡增加、Bad表达上调、Bcl-2表达下调和Caspase-3激活,表明Mdivi-1预处理在LPS诱导的ALI中起抗凋亡作用;此外,Mdivi-1预处理显著降低了 LPS诱导的肺和支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子水平、MPO活性和F4/80表达,提示肺部炎症反应的改善。[结论]:本研究表明,在脓毒症ALI大鼠模型中,Mdivi-1抑制线粒体自噬并改善LPS诱导的肺组织病理损伤、细胞凋亡、氧化应激、炎症反应和线粒体功能障碍。Mdivi-1(3或5 mg/kg)对线粒体自噬的抑制和对ALI的保护作用可能是未来脓毒症药物治疗的潜在研究方向。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R563.8;R-332
【部分图文】：

ＬＰＳ诱导的ＡＬＩ中ＴＯＭ２０和ＴＩＭ２３表达水平降低（对照组与ＬＰＳ邋＋ＤＭＳＯ组相比，逡逑Ｐ邋＜０．０５）。相反，Ｍｄｉｖｉ－１预处理抑制ＴＯＭ２０和ＴＩＭ２３表达的下调（ＬＰＳ＋ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑组与Ｍｄｉｖｉ－１组对比，Ｐ＜０．０５；图２Ｂ和Ｃ）。这种线粒体质量的损失可能由于线逡逑粒体自噬活性增强，或者是由细胞自噬的增加或线粒体生物合成减少所致。因逡逑此分析了两种细胞自噬相关蛋白ＬＣ３和ｐ６２以及两种线粒体生物合成相关蛋白逡逑ＰＧＣ－ｌａ和ｍｔ－ＴＦＡ的表达水平。结果表明在Ｍｄｉｖｉ－１预处理后ＰＧＣ－ｌｏｔ和ｍｔ－ＴＦＡ的逡逑表达没有显著下调（ＬＰＳ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－１组对比，Ｐ＞邋０．０５；图２Ｄ和Ｅ）。此逡逑夕卜，Ｍｄｉｖｉ－１预处理没有显著影响ＬＣ３－ＩＩ／Ｉ比值的上调和Ｐ６２的下调，表明自噬通逡逑量没有增强（ＬＰＳ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－１组相比，Ｐ＞邋０．０５；图２Ｆ和Ｇ）。这些数据表逡逑明Ｍｄｉｖｉ－１对线粒体质量的影响是通过抑制线粒体自噬产生的

４．邋Ｍｄｉｖｉ－１预处理抑制ＬＰＳ诱导的肺组织细胞凋亡逡逑通过ＴＵＮＥＬ染色检测发现ＬＰＳ刺激后肺组织细胞凋亡增加，Ｍｄｉｖｉ－１预处理逡逑能够改善ＬＰＳ诱导的细胞死亡（ＬＰＳ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－１组对比，Ｐ＜０．０５；图４Ａ逡逑和Ｂ）。ＬＰＳ刺激后Ｃａｓｐａｓｅ－３活性水平升高但通过Ｍｄｉｖｉ－１预处理后活性降低（ＬＰＳ逡逑＋ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－１组对比，Ｐ＜０．０５：图４Ｃ）。此外，我们检测了Ｍｄｉｖｉ－１预处逡逑理对Ｂｃｌ－２家族蛋ｈ表达调控的影响。如图４Ｄ所示，免疫组织化学染色显示逡逑Ｍｄｉｖｉ－１预处理显著阻止ＬＰＳ诱导的Ｂｃｌ－２下调和Ｂａｘ蛋白表达的上调（ＬＰＳ逡逑．ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－１组对比，Ｐ邋＜０．０５；图４Ｄ）。总之，这

５．逦Ｍｄｉｖｉ－１预处理降低ＬＰＳ诱导的氧化应激逡逑由于氧化应激参与ＡＬ丨发病机制，我们研究了邋ＬＰＳ刺激后大鼠肺组织中ＳＯＤ，逡逑ＭＤＡ和ＬＰＯ的水平。如图５所示，ＬＰＳ刺激ＰＳＯＤ的活性显著降低，ＭＤＡ和ＬＰＯ逡逑的水平显著增加（对照组与ＬＰＳ＋ｖｅｈｉｃｌｅ组对比，Ｐ＜０．０５）。然而，用Ｍｄｉｖｉ－１逡逑预处理可减少ＳＯＤ的消耗，以及ＭＤＡ和ＬＰＯ累积（ＬＰＳ邋＋ｖｅｈｉｃｌｅ组与Ｍｄｉｖｉ－丨组对逡逑比，Ｐ邋＜０．０５；图５），表明Ｍｄｉｖｉ－１改善了ＬＰＳ诱导氧化应激水平。逡逑：Ｓ0邋１逦２逦８邋１逦＊逦Ｊ００逦＊逡逑ｌ邋ｉｉｌ邋ｌ邋ｌｉ逡逑Ｖｃｈ邋Ｍｄｉ邋Ｖｃｈ邋Ｍｄｉ逦＾逦Ｖｅｈ邋Ｍｄｉ邋Ｖｅｈ邋Ｍｄｉ逦Ｖｆｈ邋Ｍｄｉ邋Ｖｅｈ邋Ｍｄｉ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＡＬＩ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＡＬＩ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＡＬＩ逡逑｛？＼）逦（ｂ）逦（0）逡逑图５．Ｍｄｉｖｉ－ｌ改善肺组织中的氧化应激。（Ａ）邋ＬＰＳ刺激引起显著的ＳＯＤ消耗，Ｍｄｉｖｉ－１预处逡逑理后降低。（Ｂ）邋ＬＰＳ诱导Ｍ著的ＭＤＡ积累，Ｍｄｉｖｉ－１预处理后减弱。（Ｃ）邋ＬＰＳ组中肺组织逡逑ＬＰＯ水平升高，Ｍｄｉｖｉ－１预处理组ＬＰＯ水平降低。结果以均数标准差（±ＳＤ）表示（每组中ｎ逡逑＝６）。＊友示１ｊ对照组相比

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