线粒体融合改变在PBDE-47致PC12细胞损伤中的作用

发布时间：2020-09-02 18:09

　　目的:多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ether,PBDEs)的发育神经毒性已引起人们的广泛关注,但其毒性作用机制尚未完全阐明。大量研究表明,PBDEs的神经毒性与线粒体损伤密切相关;本课题组前期研究显示,一定剂量的2,2',4,4'-四溴联苯醚(PBDE-47)可引起PC12细胞线粒体融合与分裂相关蛋白表达下调,同时伴有线粒体膜电位及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平下降,凋亡水平增加,细胞存活率降低,但线粒体融合与分裂抑制在该毒性过程中扮演何种角色,尚不清楚。本研究旨在探讨线粒体融合改变在PBDE-47致PC12细胞损伤中的作用,从而为进一步阐明PBDEs的神经毒性机制提供理论依据。方法:采用不同手段促进PC12细胞的线粒体融合水平,包括以下两个方面:(1)使用线粒体融合促进剂M1促进线粒体融合:将培养的PC12细胞分为对照组、20μmol/L PBDE-47处理组、20μmol/L PBDE-47+5μmol/L M1联合处理组、5μmol/L M1处理组;(2)构建融合相关蛋白线粒体融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)过表达腺病毒载体(Ad-Mfn2)促进线粒体融合:将培养的PC12细胞分为空载腺病毒处理组(对照组)、PBDE-47+空载腺病毒处理组、PBDE-47+Ad-Mfn2处理组、Ad-Mfn2处理组。细胞处理24 h后,采用Western blotting技术检测各组线粒体融合相关蛋白线粒体融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)和分裂相关蛋白分裂蛋白1(fission 1,Fis1)、磷酸化动力相关蛋白1(phosphorylation dynamin related protein 1(Serin616),~(ser616)p-Drp1)的表达水平;利用线粒体特异性的MitoTracker?Deep Red FM荧光探针标记线粒体后,使用激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞线粒体形态改变;利用线粒体膜电位依赖性的JC-1荧光探针标记线粒体后,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测各处理组细胞JC-1探针红绿荧光比例以评估线粒体膜电位的改变;通过ATP检测试剂盒检测各处理组细胞ATP水平;采用Western blotting技术和免疫荧光技术分别检测凋亡相关蛋白活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(active cysteine containing aspartate specific protease-3,active Caspase-3)的表达水平和细胞内分布情况;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各处理组细胞存活率。结果:(1)Western blotting结果显示,与对照组相比,单纯PBDE-47处理组的Mfn1、Mfn2、~(ser616)p-Drp1蛋白表达水平明显降低(P0.05);与单纯PBDE-47处理组相比,M1或Ad-Mfn2联合PBDE-47处理组的Mfn1、Mfn2、~(ser616)p-Drp1蛋白表达水平明显升高(P0.05)。(2)共聚焦观察线粒体形态结果显示,对照组线粒体主要呈丝状及长管状;与对照组相比,单纯PBDE-47处理组点状和圆球状等片段化线粒体明显增多;与单纯PBDE-47处理组相比,M1或Ad-Mfn2联合PBDE-47处理组异常线粒体明显减少。(3)线粒体功能检测结果显示,与对照组相比,单纯PBDE-47处理组的线粒体膜电位和ATP水平明显降低(P0.05);与单纯PBDE-47处理组相比,M1或Ad-Mfn2联合PBDE-47处理组线粒体膜电位和ATP水平明显升高(P0.05)。(4)凋亡相关蛋白检测结果显示,与对照组相比,单纯PBDE-47处理组active Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P0.05);与单纯PBDE-47处理组相比,M1或Ad-Mfn2联合PBDE-47处理组active Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P0.05)。免疫荧光检测发现各处理组active Caspase-3荧光着色情况与上述蛋白表达情况相一致。(5)CCK-8结果显示,与对照组相比,单纯PBDE-47处理组PC12细胞存活率明显降低(P0.05);与单纯PBDE-47组相比,M1或Ad-Mfn2联合PBDE-47处理组PC12细胞存活率明显升高(P0.05)。结论:促进线粒体融合可有效改善PBDE-47所致的神经细胞线粒体形态和功能异常,减轻细胞凋亡,提升细胞存活。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R363
【部分图文】：

PC12细胞,线粒体,处理组,细胞线粒体

华中科技大学硕士学位论文2 结果2.1 线粒体融合促进剂 M1 减轻 PBDE-47 所致 PC12 细胞线粒体融合分裂抑制实验分为对照组、20 μmol/L PBDE-47 处理组、20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/LM1 联合处理组、5 μmol/L M1 处理组。细胞处理 24 h 后，提取细胞内总蛋白，采用 Western blotting 法检测线粒体融合分裂相关蛋白的表达水平。结果如图 1 所示，与对照组相比，20 μmol/L PBDE-47 处理组 Mfn1、Mfn2 及 Fis1、p-Drp1 的蛋白表达水平均明显降低（P < 0.05）；与 20 μmol/L PBDE-47 处理组相比，20 μmol/LPBDE-47 + 5 μmol/L M1 联合处理组 Mfn1、Mfn2 及 Fis1、p-Drp1 的蛋白表达水平均显著升高（P < 0.05），表明促进线粒体融合可缓解 PBDE-47 对 PC12 细胞线粒体融合分裂的抑制作用。

线粒体形态,PC12细胞,线粒体,圆球

华中科技大学硕士学位论文状线粒体明显减少，而点状及圆球状等片段化线粒体明显增多。与 20 μmol/LPBDE-47 处理组相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1 联合处理组点状及圆球状等片段化线粒体明显减少，表明促进线粒体融合可以缓解 PBDE-47 所致 PC12细胞线粒体形态片段化改变。

条图,线粒体功能,PC12细胞,处理组

图 3 M1 对 PBDE-47 致 PC12 细胞线粒体功能损伤的影响注：（A）线粒体膜电位 JC-1 荧光图；（B）线粒体膜电位统计条图；（C）ATP 水平统计条图。与 Control 组相比，*P < 0.05；与 PBDE-47 组比，#P < 0.05。2.4 M1 减轻 PBDE-47 所致 PC12 细胞凋亡实验分组及细胞处理同上。分别采用 Western blotting 技术和免疫荧光法检测凋亡相关蛋白active Caspase-3的表达水平及其在胞内分布情况。结果如图4所示，与对照组相比，20 μmol/L PBDE-47 处理组 active Caspase-3 蛋白表达水平明显增加（P < 0.05）；与 20 μmol/L PBDE-47 处理组相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1联合处理组 active Caspase-3 的蛋白表达水平显著降低（P < 0.05）。共聚焦结果也有相似发现，对照组显示 active Caspase-3 的绿色荧光聚集较少；与对照组相比，20 μmol/L PBDE-47 处理组细胞质中绿色荧光明显增强；与 20 μmol/L PBDE-47 处理组相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1 联合处理组绿色荧光明显减少。这些结果表明，促进线粒体融合可抑制 PBDE-47 引起的 PC12 细胞凋亡。

【参考文献】