人巨细胞病毒蛋白IE86与自噬相关蛋白Atg3相互作用的验证

发布时间：2020-09-04 17:52

　　 【背景】研究发现,HCMV在感染早期可短暂激活细胞自噬,随后抑制自噬。HCMV与细胞自噬相互作用可调控病毒复制水平。然而,HCMV调控自噬的具体分子机制尚不明确。本课题组前期研究中,利用酵母双杂交技术检测到MCMV的M122蛋白与自噬的重要调节分子—自噬相关蛋白3(Atg3)存在相互作用。我们推测,HCMV也可能通过其蛋白IE86(与MCMV-M122同源)与Atg3相互作用而调控细胞自噬。【目的】检验HCMV IE86蛋白与人Atg3蛋白是否存在相互作用,为HCMV IE86蛋白的功能研究提供实验依据和线索。【方法】1.目的基因克隆载体构建:根据目的基因UL122和ATG3蛋白质编码序列设计PCR引物,RT-PCR法扩增相应目的片段并电泳回收,利用TA克隆技术将目的基因分别插入到pMD18T质粒中,构建pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3重组克隆载体,双酶切及测序鉴定;2.目的基因表达载体构建:以pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3为模板,PCR扩增目的基因并电泳回收;双酶切pc DNA3.1质粒并电泳回收;利用In-fusion技术将目的片段分别插入到pc DNA3.1质粒中,构建pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重组表达载体,双酶切及测序鉴定;3.目的蛋白的表达:提取无内毒素的pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3质粒,利用lipo3000将质粒转染到HEK293T细胞中,提取蛋白后,应用Western Blotting检测目的蛋白的表达;4.免疫共沉淀验证蛋白相互作用:目的基因在HEK293T中表达后,提取蛋白,应用免疫共沉淀技术检测IE86与Atg3是否存在相互作用。【结果】1.成功构建pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3重组克隆载体,双酶切及测序鉴定无误;2.成功构建pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重组表达载体,双酶切及测序鉴定无误;3.pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3可在HEK293T细胞中分别成功表达IE86和Atg3蛋白;4.免疫共沉淀技术未能证实IE86与Atg3存在相互作用。【结论】1.成功构建了用于哺乳细胞表达的pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重组表达载体,并在HEK293T中成功表达IE86和Atg3蛋白,为相关蛋白的功能研究奠定基础;2.IE86与Atg3可能不存在相互作用,HCMV可能通过其他机制调控自噬。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373
【部分图文】：

25图 1 PCR 产物电泳图酶切鉴定 BamH I 和 EcoR I 分步双酶切重组质粒物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图 2条带在 2000bp～3000bp 之间，与载体 pM 1500bp～2000bp 之间，与目的基因 UL1在 2000bp～3000bp 之间，与载体 pMD18 1000bp，与目的基因 ATG3（945bp）大小

图 2 重组克隆载体双酶切产物电泳图122 酶切产物电泳图；2：pMD18T-ATG3 酶切测序鉴定正确的质粒送测序，测序结果经过 BLAST 基序列与目的片段完全符合，插入位置正确

pMD18T-UL122正向测序图，其中第60位为插入起始位点

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本文编号：2812405