DMP1敲除兔低血磷性佝偻病模型的建立

发布时间：2020-09-03 10:28

　　低血磷性佝偻病(Hypophosphatemic Rickets,HR)是由肾脏中磷酸盐的丢失导致血磷降低,最终引起骨骼矿化异常的一类骨疾病。常染色体隐性遗传低血磷性佝偻病(Autosomal Recessive Hypophosphatemic Rickets,ARHR)是其中的一种,主要表现为佝偻病和骨软化症等,同时伴有身材矮小,骨骼及牙齿发育异常,血清FGF23水平升高,血磷降低等临床症状。ARHR的主要致病基因为DMP1(Dentin Matrix Protein 1)基因,位于人染色体4q21-22,含有7个外显子,编码一种在骨骼和牙齿中高表达的酸性非胶原蛋白,在骨和牙齿的形成和矿化过程中发挥重要作用。DMP1通过成纤维细胞生长因子23(FGF23),一种由骨细胞和成骨细胞合成的具有内分泌功能的蛋白质,调节体内磷酸酶的稳态,加速磷酸盐代谢,进而调节血磷水平。因此,对DMP1的研究有助于提高人们对骨骼矿化、肾脏中磷转运机制的认识,进而揭示ARHR的发病机理。随着科学技术的发展,人们迫切希望对疾病有更深刻的了解。研究发现,疾病的发生与基因突变密切相关。但由于临床表现的复杂性,疾病的发病机理尚不明确,因而缺少有效的预防和治疗措施。因此,建立模拟人类疾病的动物模型对于疾病发病机理的研究以及治疗方法的筛选至关重要。目前,研究人员已经成功建立了小鼠的ARHR模型。但是由于小鼠骨组织形态学特点和关节炎的病理变化与人类存在差异,不能完全模拟人类ARHR疾病。而兔作为一种经典的模式动物,它的生理结构与人类更为相似,同时还具有饲养费用低、妊娠周期短等优点,是一种模拟人类疾病的更为可靠的、理想的模式动物。本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术对兔DMP1基因进行编辑,成功获得了DMP1基因敲除兔,并且经过检测未发现脱靶现象。对DMP1基因敲除兔表型鉴定,结果发现:DMP1基因敲除兔调磷基因表达异常,血清中FGF23升高、血磷降低。牙齿,下颌体,长骨等多处骨骼矿化不全,骨密度降低。肋骨和椎骨具有佝偻病典型症状,出现“串珠状”结节。长骨发育异常,骨细胞突变,造成长骨变短变粗。这些表型与人类ARHR患者的临床表现相一致。兔ARHR模型的建立有助于揭示人类ARHR的发病机理,同时为ARHR的药物筛选和临床治疗提供理想的动物模型。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R-332;R591.44
【部分图文】：

甲状旁腺激素,磷酸盐,矿物质,肾小管

甲状旁腺激素调节磷酸盐[54]

位点,基因,实验分析,外显子

1.2.8 T7EI 实验分析T7EI 实验分析，利用琼脂糖电泳对结果进行分析鉴定，方法如下：取 8 μLPCR 产物，向其中加入 2 μL NEBuffer2，放入 PCR 中，95℃10 分钟，放入室温中自然降温，然后加入 T7EI 0.5 μL，在 37℃条件下 30 分钟后可鉴定。1.3 实验结果1.3.1 兔 DMP1 sgRNA 敲除靶位点设计在 NCBI 中，依照 GeneBank 上兔 DMP1 基因序列，分别在第一个和第二个外显子上分别设计打靶位点，图 1.1。其中蓝色矩形框表示 DMP1 基因的外显子，红色代表两个 sgRNA 的靶位点，蓝色代表 PAM 区。

基因组测序,实验结果分析,基因型,产物鉴定

24图 1.2 T 载体克隆基因组测序 DMP1 敲除兔基因型Fig. 1.2 Tvector cloning genome sequencing of DMP1 KO rabbit1.3.4 脱靶实验结果分析为检测 DMP1 基因敲除兔中是否有脱靶效应，根据上述设计的 5 对引物，进行 PCR 扩增及 T7EI 酶切实验。结果如图 1.3。PCR 产物鉴定及 T7EI 酶切结果显示没有脱靶现象。

【参考文献】