CRISPR干扰系统的建立及其在分枝杆菌重要基因功能研究中的应用

发布时间：2020-09-07 11:26

　　第一部分分枝杆菌中CRISPR干扰系统的建立目的:目前,进行结核分枝杆菌重要基因(尤其是必需基因)功能方面的研究受限于缺乏有效的技术工具定向删除或失活结核分枝杆菌指定基因,无论是传统的还是新兴的基因编辑技术所引起的必需基因的敲除会直接造成细菌突变株不能成功制备,使得进行必需基因的功能研究无从谈起。本研究以功能已知基因pkn B为靶基因,国内首次在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中构建新型CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇规律间隔短回文重复序列)干扰系统,同时摸索如何提取高质量的且适合于进行分枝杆菌基因表达检测的RNA,以及如何利用3':5'比率法定量检测分枝杆菌RNA完整性。本研究构建的CRISPR干扰系统将来可为分枝杆菌重要基因的功能研究及结核病的防治奠定重要的技术理论基础。方法:本研究应用的两个载体为p RH2502载体(dcas9表达载体)(dead CRISPR-associated protein 9,dCas9,无活性CRISPR相关蛋白9)和p RH2521载体(sg RNA表达载体)(single-guide RNA,sg RNA,单链引导RNA),先将p RH2502载体电转感受态的耻垢分枝杆菌,获得可稳定表达dcas9的菌株;再经脱水四环素(anhydrotetracycline,a Tc)诱导培养12 h,提取和纯化分枝杆菌RNA,检测RNA的纯度和完整性,确定获得高质量分枝杆菌RNA的实验方法;然后利用逆转录定量PCR(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法,进行3':5'比率法以检测样本RNA的完整性、进行连续稀释双标准曲线法以检测样本dcas9的表达;四环素诱导过程中绘制细菌的生长曲线,检测过表达的dcas9对细菌生长的影响。另一个表达载体p RH2521经酶切、去磷酸化和胶回收等步骤,靶基因pkn B特异性寡核苷酸单链经化学合成、退火和磷酸化等步骤,二者再经连接、转化、测序验证和质粒提取,以获得表达靶基因pkn B特异性sg RNA的p RH2521表达载体。将靶基因特异性的p RH2521表达载体电转到之前获得的已稳定表达dcas9的耻垢分枝杆菌;经四环素诱导培养12 h,提取和纯化分枝杆菌RNA,检测RNA的纯度和完整性;利用RT-q PCR方法,进行3':5'比率法以检测样本RNA的完整性、进行连续稀释双标准曲线法以检测dcas9和靶基因pkn B的表达;四环素诱导过程中绘制细菌的生长曲线,检测敲低的pkn B对细菌生长表型的影响。目的基因的相对表达量用平均值±标准差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)进行统计学分析。结果:(1)结果显示,CRISPR干扰(CRISPRi,CRISPR interference)技术成功地诱导了耻垢分枝杆菌中dcas9的过表达,经计算a Tc-12h组(四环素诱导12 h组)dcas9表达量约是N-a Tc-0h组(无四环素诱导0 h组)的271.4±75.3倍,差异具有统计学意义,且过表达的dcas9对细菌的生长没有毒性作用;CRISPRi技术成功地敲低了靶基因pkn B,经计算N-a Tc-0h组pkn B表达量约是a Tc-12h组的3.94±1.76倍,即靶基因pkn B被敲低了约74%,差异具有统计学意义,但在四环素诱导12 h时敲低的pkn B所引起的分枝杆菌生长表型上的变化并不明显,可延长观察时间以得到进一步的实验结论。(2)本研究所提取的RNA,经超微量紫外分光光度计测定,A260/280在1.8至2.0之间,样本RNA溶液的纯度好;经琼脂糖凝胶检测,23S片段的亮度是16S片段的2倍左右,RNA条带锐利、无5S小片段弥散现象,样本RNA的完整性较好。(3)经3':5'比率法定量检测样本RNA的完整性,结果示各样本的3':5'比率在1.1-3.6之间,样本RNA的完整性较好。结论:(1)本研究在分枝杆菌中成功建立了CRISPR干扰系统,包括成功诱导耻垢分枝杆菌中dcas9的过表达和成功敲低靶基因pkn B,该系统的建立为分枝杆菌重要/未知基因的功能研究奠定了重要的技术基础。(2)本研究建立了获取高质量且适合于进行分枝杆菌基因表达检测的RNA的实验方法,实验证实使用含溶菌酶和蛋白酶K的TE缓冲溶液、利用热Trizol法和机械破碎法、使用试剂盒纯化RNA、进行痕量DNA的去除等都是提取和纯化分枝杆菌中RNA的关键步骤。(3)本研究建立了3':5'比率法定量检测分枝杆菌RNA完整性的实验方法,该方法为后续基因表达定量检测结果的科学性和可靠性提供了重要的实验依据。第二部分CRISPR干扰系统在分枝杆菌重要基因功能研究中的应用目的:本研究是第一篇利用新型CRISPR干扰系统敲低耻垢分枝杆菌F基因并研究该基因功能的实验研究。本研究首先利用CRISPR干扰系统敲低Msm_F基因,通过检测敲低的Msm_F所引起的细菌生长表型和形态表型的变化,以揭示该基因作为必需基因在分枝杆菌中分化中所发挥的作用。其次,通过对脱靶基因表达水平的检测,以验证CRISPR干扰系统的低脱靶效应。再通过对两个相互作用基因Msm_fts Z和Msm_mur G表达水平的检测,以揭示Msm_F基因与细胞重要分化蛋白的编码基因之间相互作用的机制。另外,在上述利用CRISPRi技术敲低Msm_F基因的过程中,确立一个简单且操作性强的方法以实现CRISPRi靶向位点的有效选择和sg RNA脱靶效应的预测评估。方法:本研究根据靶基因Msm_F编码区靠近5'端所有PAM序列“5'-CCN-3'”(protospacer-adjacent motif,前间隔序列毗邻基序)后面的20 nt序列,添加相应的酶切位点,设计可结合到靶基因编码区正义链上的sg RNA,经CAS OT软件预测,入选了三条在耻垢分枝杆菌基因组中脱靶位点少的sg RNA,分别命名为Msm_F-1、Msm_F+46和Msm_F+101,将设计的两条互补的寡核苷酸单链进行化学合成、退火和磷酸化,再与已线性化的酶切p RH2521表达载体进行连接、转化、测序验证和质粒提取等步骤,最后获得3个分别靶向靶基因Msm_F三个位置的特异性sg RNA的p RH2521表达载体,同时还需设计一个不靶向分枝杆菌基因组内任何一个基因的对照sg RNA并进行相应p RH2521表达载体的构建。将3个靶基因特异性的p RH2521表达载体和一个sg RNA对照p RH2521表达载体分别电转之前获得的已稳定表达dcas9的耻垢分枝杆菌;经四环素诱导培养,提取和纯化分枝杆菌RNA,检测RNA的纯度和完整性;利用RT-q PCR的方法,进行3':5'比率法以检测样本RNA的完整性、进行连续稀释双标准曲线法以检测dcas9、靶基因F、四个脱靶基因(MSMEG_6529、MSMEG_5505、MSMEG_1378和MSMEG_5373)和两个相互作用基因(Msm_fts Z和Msm_mur G)的表达;四环素诱导过程中绘制细菌的生长曲线并观察菌液状态,以检测敲低的F对细菌生长表型的影响;四环素诱导12 h时镜下观察细胞形态,以检测敲低的F对细菌形态表型的影响。目的基因的相对表达量用平均值±标准差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)进行统计学分析。结果:(1)结果显示,CRISPRi技术成功地诱导了耻垢分枝杆菌中dcas9的过表达和靶基因F的敲低,经计算Msm_dcas9+F-1、Msm_dcas9+F+46和Msm_dcas9+F+101三种菌株a Tc-12h组dcas9表达量分别是N-a Tc-0h组的180.0±43.7、262.0±60.7和208.3±36.4倍,差异具有统计学意义,三种菌株N-a Tc-0h组F表达量分别是a Tc-12h组的60.7±11.9、18.8±1.7和38.3±8.3倍,即F基因分别被敲低了98%、95%和97%,差异具有统计学意义;而对照组Msm_dcas9+control菌则仅有dcas9表达的升高,没有F的敲低。(2)结果显示,敲低的Msm_F可以引起细菌生长表型和形态表型的变化,主要表现为在四环素诱导9 h时即出现的生长减慢现象和24 h时出现的细菌大量死亡的现象,以及在四环素诱导12 h时镜下即可见菌体变长、呈丝状化和产生分叉的现象,据肉眼直接估计a Tc组多数细菌的菌体长度最少增加了约2.5倍。(3)经计算,与各菌株的N-a Tc-0h组相比,Msm_dcas9+F-1菌可能的脱靶基因MSMEG_6529、Msm_dcas9+F+46菌可能的脱靶基因MSMEG_5505以及Msm_dcas9+F+101菌可能的脱靶基因MSMEG_1378和MSMEG_5373在a Tc-12h组中的相对表达量分别为0.86±0.21、0.91±0.15、0.82±0.18和0.87±0.14,差异无统计学意义,即上述基因的表达均未受到脱靶效应的影响。(4)经计算,在Msm_dcas9+F-1菌中,与N-a Tc-0h组相比,fts Z和mur G在a Tc-12h组中的相对表达量分别为0.93±0.09和0.96±0.09,差异无统计学意义,即敲低的F并未影响F相关基因——fts Z和mur G的表达。(5)另外,在上述利用CRISPRi技术敲低Msm_F基因的过程中,关于CRISPRi靶向位点的选择,本研究经实验证实,所设计的3个sg RNA均十分有效地敲低了靶基因,有效率100%;关于sg RNA脱靶效应的预测评估,本研究发现,CAS OT软件可以在耻垢分枝杆菌中实现对sg RNA所靶向的潜在脱靶结合位点的有效搜寻。(6)本研究还首次利用一段土豆的序列(称之为SPUD序列)设计实验所需的对照sg RNA,经CAS OT软件分析发现,设计的4条sg RNA与分枝杆菌全基因组≤5个不匹配碱基的脱靶位点数均为0-1个,该段序列适合用于不靶向分枝杆菌基因组内任何一个基因的对照sg RNA的设计。结论:(1)本研究首次应用新型CRISPRi技术在天然水平上成功敲低了耻垢分枝杆菌重要基因F。(2)本研究发现敲低的Msm_F可以引起细菌生长表型和形态表型的变化,本研究证实F作为耻垢分枝杆菌必需基因在细胞分化过程中发挥着重要的作用。(3)通过对四个脱靶基因的表达进行检测,本研究证实CRISPRi技术具有较低的脱靶效应。(4)通过对两个相互作用配体Msm_fts Z和Msm_mur G的表达进行检测,本研究推测Msm_F的作用并不是通过影响两个相互作用配体Msm_fts Z和Msm_mur G的表达水平来实现的,而是通过结构上的相互作用实现的。(5)另外,在上述利用CRISPRi技术敲低Msm_F基因的过程中,关于CRISPRi靶向位点的选择,本研究建议,设计多个结合到靶基因正义链编码区靠近5’端的sg RNA是一个简单有效且操作性强的方法;关于sg RNA脱靶效应的预测评估,本研究认为,CAS OT软件可以应用于耻垢分枝杆菌和其他一些没有专业数据库网站的细菌,该软件可为研究者挑选低脱靶效应的sg RNA提供有效的预测依据。(6)本研究首次利用一段土豆的SPUD序列设计不靶向分枝杆菌基因组内任何一个基因的sg RNA,并经CAS OT软件分析证实该段序列确实与分枝杆菌(包括耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌)全基因组序列的同源性较差。
【学位单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【部分图文】：

序列,免疫系统,前间隔,双链

图 1 CRISPR 介导的免疫系统[12]天然状态下，CRISPR-Cas9 系统保护细菌和古生菌免受外来质粒或的免疫过程分为三个阶段（见图 1）。获取阶段，细菌或古生菌通过PR-Cas9 系统识别首次入侵的 DNA 中的前间隔序列（proto-spacer）序列（protospacer-adjacent motif，前间隔序列毗邻基序），利用 Cas1将前间隔序列加工成为新的重复-间隔序列整合到 CRISPR 簇内。表达源基因再次入侵时，细菌转录重复-间隔序列形成 pre-crRNA（pre-CR），pre-crRNA 的重复序列与同时被转录的 tracrRNA（trans-activating C，反式激活 crRNA）互补结合形成双链 RNA，在 Cas9 蛋白的协同下被ibonuclease III，核糖核酸酶 III）加工处理为成熟的 crRNA。干扰阶A-tracrRNA-Cas9 蛋白复合体结合到与 crRNA 互补的靶基因上，Cas个结构域（RuvC 和 HNH）各剪切 DNA 双链中的一条链，引入双链之后宿主通过 HR（homologous recombination，同源重组）或 NHEJ

原理图,编辑技术,基因,原理

北京市结核病胸部肿瘤研究所博士学位论文erichia coli）靶基因的启动子区或 ORF 区，通过阻止 RNAP（RNerase，RNA 聚合酶）与靶基因启动子的结合干扰转录的起始或作为扰转录的延伸，研究者将该技术命名为CRISPRi技术（CRISPR inteR 干扰技术）（见图 2）。该研究发现，dCas9 结合到启动子区可以0 倍的基因表达抑制效果；dCas9 结合到编码区也可抑制基因的表非模板链的效果要比模板链好；另外，可通过设计多个 sgRNA 的抑制多个基因或提高对同一基因抑制效果的目的。与 Cas9 蛋白相Ri 技术中的 dCas9 蛋白可同时抑制多个基因却并不需要对基因进Cas9 在重要/未知基因尤其是必需基因的功能研究方面更具优势。

图谱,载体

pRH2502载体图谱

【参考文献】