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TLR2基因敲除对小鼠心脏移植排斥反应的影响及机制

发布时间:2020-09-08 09:56
   研究背景:我们前期实验表明可产生白细胞介素-17(IL-17)的同种反应性T细胞在小鼠心脏移植急性排斥反应早期阶段发挥主要作用,阻断IL-17可明显延长心脏移植物存活时间。Toll样受体2(TLR2)在不同疾病模型和条件下对Th17细胞的分化发挥着不同的作用。TLR2信号通路对经过同种抗原刺激后所产生的IL-17+T细胞的调节作用尚未见报道。研究目的:在本研究中,我们使用小鼠心脏移植急性排斥反应模型来研究器官移植受者小鼠TLR2基因敲除对急性排斥反应的影响,以及TLR2信号通路对同种反应性IL-17+T细胞的调节作用。研究方法:1.小鼠心脏移植急性排斥反应模型的制备:采取腹部异位小鼠心脏移植模型。在急性排斥反应模型中,供者为BALB/c小鼠,受者为C57背景的野生型小鼠(WT)或TLR2基因敲除小鼠(TLR2---)。在同系移植模型中,供者为C57野生型小鼠,受者为C57背景的WT小鼠或TLR2-/-小鼠。2.体内实验相关的检测方法与指标:(1)记录各组心脏移植物生存曲线;HE染色检测心脏移植物炎性细胞浸润及心肌损害情况,并采用国际心脏与肺移植协会(ISHLT)心脏移植物急性排斥反应病理评分标准进行评分;(2)免疫组织化学染色法检测心脏移植物中性粒细胞和巨噬细胞的浸润;(3)流式细胞术检测脾脏和心脏移植物中IL-17+CD3+T细胞、IL-17+CD4+T细胞(Th17)、IL-17+γδT细胞、IL-17+CD8+T细胞、IFN-γ+T细胞及调节性T细胞等细胞群的变化;(4)流式细胞术检测脾脏树突状细胞(DC)和巨噬细胞中IL-6的表达情况;(5)荧光定量PCR法检测心脏移植物中IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL20、CCR6、IL-10、IL-4、IFN-γ等细胞因子的表达;(6)蛋白免疫印迹法检测脾脏和心脏移植物STAT3和p-STAT3的水平。3.体外实验相关的检测方法与指标:(1)将受者来源T细胞和供者来源BMDC的混合培养,应用IL-6和TGF-β刺激,流式细胞术检测TLR2-/-和WT组Th17及IL-17+γδT细胞的变化;(2)将受者来源脾细胞和供者来源BMDC进行混合培养,流式细胞术检测TLR2-/-WT组Th17及IL-17+γδT细胞的变化;ELISA法检测细胞培养上清IL-6的水平;(3)将受者来源脾细胞和供者来源BMDC的混合培养,应用IL-6抗体阻断后,流式细胞术检测TLR2-/-和WT组Th17及IL-17+γδT细胞的变化。研究结果:1.本研究成功建立同种异体小鼠心脏移植急性排斥反应模型;2.受者TLR2敲除后,对小鼠心脏移植急性排斥反应产生如下影响:(1)受者TLR2敲除导致心脏移植物中炎性细胞浸润增多,心肌损害加重,排斥反应加剧;(2)受者TLR2敲除导致心脏移植物中中性粒细胞和巨噬细胞浸润增加;(3)TLR2缺失促进受者脾脏同种反应性Th17细胞和IL-17+γδT细胞比例增加,心脏移植物中同种反应性Th17细胞、IL-17+γδT细胞及总T细胞数量增加。(4)TLR2缺失对IFN-γ+T细胞(包括Th1细胞)无明显影响;(5)受者TLR2敲除可上调同种心脏移植物中IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL20及CCR6的表达;3.小鼠心脏移植急性排斥反应中,受鼠TLR2缺失促进DC分泌IL-6增多,从而导致同种反应性IL-17+T细胞增加,具体包括:(1)T细胞本身TLR2缺失不会影响T细胞经过同种抗原刺激后,同种反应性Th17细胞和IL-17+γδT细胞的分化能力;(2)IL-6促进TLR2-/-组同种反应性Th17细胞和IL-17+γδT细胞的分化,阻断IL-6可使TLR2-/-组同种反应性Th17细胞和IL-17+γδT细胞比例明显降低;(3)小鼠心脏移植排斥反应中,TLR2敲除导致DC分泌IL-6增加。4.TLR2敲除导致受鼠脾脏和移植物中STAT3磷酸化增加;5.体内外实验表明,TLR2敲除导致调节性T细胞扩增减少。研究结论:1.受者TLR2敲除可加重小鼠心脏移植排斥反应;2.受者TLR2敲除可促进同种反应性Th17细胞和IL-17+γδT细胞应答;3.受者TLR2敲除促进DC分泌IL-6增加,从而促进Th17细胞和IL-17+γδT细胞分化。同时,TLR2敲除可导致STAT3磷酸化增加;4.TLR2信号通路在同种移植排斥反应中的作用值得进一步的关注。
【学位单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2019
【中图分类】:R654.2;R-332
【部分图文】:

和同,排斥反应,同种移植,同系


图1心脏移植物病理学检测逡逑在移植手术武S猓程欤停旱冢诽欤直鸫樱呱褚浦步悖ǎ粒欤欤铮纾澹睿澹椋悖屯刀跃驘a(Synge提取心脏移植物弁进坓常规H&E染色(放大倍数400)?每组3只小鼠,进行3次独立逡逑实验。逡逑3、心脏移植排斥反应病理评分逡逑根c玻甒 :际心脏与肺移楦协会(International邋Society邋of邋Heart邋and邋Lung逡逑Transplantation,ISHLT)制定的'心脏移植物急性排斥反应病理评分标准对各组进逡逑行评分。结果如图2所示在移植后第3天,同种移植WT组ISHLT评分为1,逡逑为轻度排斥反应;而间种移植TLE^taiSHLT评分为2,即中度排斥反应.。在逡逑第7天,同种移植WT组和TLR2vta邋ISHLT评分都达到3,即重度排斥反应。逡逑于此同时,.同系对照WT组和TLR2+组在第3夭和7夫评分都为0,没有发生排逡逑

排斥反应,同种移植,急性排斥反应,心脏移植


根c玻甒 :际心脏与肺移楦协会(International邋Society邋of邋Heart邋and邋Lung逡逑Transplantation,ISHLT)制定的'心脏移植物急性排斥反应病理评分标准对各组进逡逑行评分。结果如图2所示在移植后第3天,同种移植WT组ISHLT评分为1,逡逑为轻度排斥反应;而间种移植TLE^taiSHLT评分为2,即中度排斥反应.。在逡逑第7天,同种移植WT组和TLR2vta邋ISHLT评分都达到3,即重度排斥反应。逡逑于此同时,.同系对照WT组和TLR2+组在第3夭和7夫评分都为0,没有发生排逡逑斥反应》队土结果提示,TLR2基因敲除可导致小鼠心脏移植急性排斥反应早期逡逑移植物中炎性细胞浸润增多及排斥反应加灄a逡逑26逡逑

存活曲线,存活曲线,同种移植,同系移植


Allogeneic逦Syngeneic逡逑图2心脏移植排斥反应病理学评分逡逑根据ISHLT制定的心脏移植物急性排斥反应病理评分标准对各组进行评分,分值越高逡逑排斥反应越严童,每组3只小鼠,进行3次独立验。逡逑4、心脏移植物存活曲线逡逑移植手术后对受鼠每日行腹部触诊,评估心脏搏动,记录移植物存活时间。逡逑结果如祖3所示,同种移植WT组平均存活天数为6.70±0.21天,同种移植TLR2_A逡逑组心脏移植物平均存活天数为5.75±0.10天,两组具有统计.学差异(p<0.01),提逡逑示TLR2基因敲除可加速移植物排斥反应。同系对照组(包括同系移植WT和逡逑TLR2_A组)存活天数均大于30天。逡逑

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本文编号:2814038

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