大鼠脑缺血模型侧支循环研究及差异表达lncRNA分析

发布时间：2020-09-09 14:45

　　 目前在侧支循环的研究中,多集中在急性缺血方面,而对慢性缺血侧支循环的研究却较少。将两者进行对比研究未见有报道。随着近年来基因技术、分子生物学和基因测序技术的进步,发现长链非编码RNA在细胞的增殖、分化、代谢凋亡等方面有着重要的调控作用,人类疾病的发生、发展也和它有密切关系。特别在血管内皮细胞和血管平滑肌的研究中发现lncRNA在许多方面对其有调控作用。侧支循环建立形成的基因调控目前仍未完全清楚,并且大部分研究集中于mRNA。lncRNA调控侧支循环的研究却鲜有报道。因此我们构建了大鼠急性和慢性缺血模型,进一步观察大鼠急性或者慢性缺血状态下颅内各个血管变化进一步寻找可能的影响因素。同时对大鼠脑缺血区的脑血管做了二代的RNA-seq高通量测序。我们试图在大鼠脑急性缺血模型和慢性缺血模型中寻找在血管生成和侧支循环形成的异同,为可能的基因调控靶点提供一些证据。第一部分大鼠急性、慢性缺血模型及侧支循环的建立试验方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,选成年雄性Wistar健康大鼠,随机分成三组:A组(假手术组),B组(MCAO模型组),C组(慢性缺血组)。所有大鼠造模后均行激光散斑成像观察,分别于苏醒后2小时、12小时、24小时、48小时、72小时和1周每个时间段行神经功能评分,后4个阶段每组处死3只大鼠取脑,行HE和CD105染色,观察脑侧支循环建立和血管生成。结果:TTC染色示:B组梗死面积百分比达到20.30±4.62%,C组梗死面积百分比为3.02±1.26%。激光散斑血流图示:在A组造模后,脑血流无明显变化。B组在MCAO侧脑灌注明显减少,降幅达60%以上,在梗死后软膜动脉既开放向缺血区供血。C组全脑灌注明显减低达50%以上,早期大脑中、大脑前仍有血流,较前明显减少。HE染色B组脑组织水肿,病变区血管充血扩张大量神经细胞死亡,C组在部分可见有少量血管充血,大脑皮层及海马区可见部分神经细胞变性皱缩坏死,结构稀疏。CD105染色示在B组梗死核心区和梗死灶周边均有新生血管生成,梗死灶周边明显,随着梗死时间延长新生血管逐渐增多,7天时最多。C组也有新生血管生成,相对B组较少。第二部分缺血后大鼠脑血管差异表达RNA研究试验方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,选成年雄性Wistar健康大鼠,随机分成三组:A组(假手术组),B组(MCAO模型组),C组(慢性缺血组)。模型建立后48小时处死大鼠,立刻取右侧缺血区脑血管,提取RNA,行二代高通量RNA-seq测序。利用Ballgown对两组转录本进行比较,寻找差异基因,应用KEGG数据库进行GO分析、pathway分析,构建信号传导网络(signal-net)分析和lncRNA与mRNA共表达网络(lncRNA-mRNA-net)分析。qRT-PCR验证RNA-seq测序结果。结果:1、急性缺血组与对照组lncRNA与mRNA的分析:较筛选出差异lncRNA 71个差异基因,其中34个上调,37个下调。mRNA有1963个,其中上调的有1142个,下调821个。在mRNA相互作用网络中,与血管生成相关的mRNA中,基因Tek、Kdr、Plcb4和Plcg1在整个调控网络起到了非常重要作用。Tek、Kdr能够通过激活Plcb4对Prkce、Prkcb、Prkca、Itpr1、Pla2g4a、Mapk13和Mapk11组成的网络进行调控。Kdr也能够通过Plcg1对上述网络进行调控。Itgb2能够通过调控Fgf2来影响Adcy5继而影响上述调控网络。ENSRNOT00000036680、ENSRNOT00000084727同时对Plcg1调控,前者为正向调控,后者为负向调控。Tek未发现有lncRNA调控,对Kdr调控的lncRNA有三个,其中ENSRNOT00000077132调节能力最强为负向调控,ENSRNOT00000092096为正向调控。ENSRNOT00000073655对Plcb4进行负向调控。ENSRNOT00000087051对Adcy5进行正向调控。2、慢性缺血组与对照组lncRNA与mRNA的分析:筛选出差异lncRNA276个差异基因,其中66个上调,160个下调。mRNA有3289个,其中上调的有1776个,下调1513个。在mRNA的相互作用网络中,与血管生成有关的mRNA中,Mapk1、Prkca同Nras和Kras构成了主要的相互作用网络。Nras、Kras与Mapk1将作用更密切并能调控Mapk8、Mapk9。我们推测在慢性缺血的过程中血管的生成主要是通过对Mapks调控。通过lncRNA与mRNA共表达网络分析发现ENSRNOT00000092872对Kras进行负向调控,ENSRNOT00000076004对Nras调控。对Mapk1调控的lncRNA中作用最强的是ENSRNOT00000090397和ENSRNOT00000076495,前者为负向调控。ENSRNOT00000092832对Prkca进行调控。3、慢性缺血组与急性缺血组lncRNA与mRNA的分析对比急性和慢性缺血组的RNA数据分析:在有血管生成有关的mRNA中,在两组中均有表达的有330个。差异表达在4倍以上的有21个。Kcnab2、Atp6v1g2、Stmn4、Stim1、Cyp1b1、Fgf2等差异基因两组之间是反向调节,而Kng2在两组之间均为上调但B组差异倍数更显著。B组与C组之间GO分析和pathway分析对比发现,Kcnab2、Stmn4仅在C组中有显著性差异。Stim1、Cyp1b1仅在C组中有显著性差异。Atp6v1g2在离子跨膜运输功能上B组为下调,C组上调,代谢通路上B组为下调,C组上调。从上数据我们可以看出,Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C两组中具有相同的功能,相同的调控通路。ENSRNOT00000087079在调控Stmn4的lncRNA中调控能力最强。ENSRNOT00000002990对Serpine1负向调控,但在C组中ENSRNOT00000076446的调控能力较ENSRNOT00000002990强,正向调控。对Kng2的调控两组没有相同的lncRNA。在两组中ENSRNOT00000079300对lgf1调控均为负向调控。ENSRNOT00000092605对Atp6v1g2在两组中均为正向调控,但在C组中ENSRNOT00000089288的调控能力较ENSRNOT00000092605强,负向调控。结论:1、急性梗死超早期的侧支循环建立以固有动脉为主,如Willis动脉环,软膜动脉。梗死后血管新生发生在24h内出现,随着梗死时间延长,血管新生越明显,7天时仍有明显血管新生。血管新生在梗死灶核心和周边均有,周边明显增多。慢性血管狭窄颅内侧支循环的建立主要以固有动脉为主,也存在部分血管新生但较急性脑梗死少。2、急性缺血模型中Tek、Kdr、Plcb4、Plcg1对血管生成有重要调控作用,可能是通过VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等通路调控进行调控,其中Mapks信号通路作用可能更明显。ENSRNOT00000077132、ENSRNOT00000092096和ENSRNOT00000073655对上述mRNA起到了调节作用。3、慢性缺血模型中Mapk1、Prkca、Nras和Kras等基因在其中起到了重要作用调控作用,其PI3K-Akt信号通路和Mapk信号通路在其中贡献较大。ENSRNOT00000092872、ENSRNOT00000076004和ENSRNOT00000092832等lncRNA对上述mRNA的调控作用强。4、Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C两组中具有相同的功能,相同的调控通路。在两组中ENSRNOT00000079300对lgf1调控均为负向调控。ENSRNOT00000092605对Atp6v1g2在两组中均为正向调控,但在C组中ENSRNOT00000089288的调控能力较ENSRNOT00000092605强,负向调控。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743;R-332

【参考文献】

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本文编号：2815104