人脱落乳牙牙髓干细胞在乳牙生理性根吸收中调控作用机制的研究

发布时间：2020-09-09 18:57

　　 [目的]通过间接共培养的方法初步探讨人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)在体外促进破骨前体细胞向破骨细胞分化的能力及其影响机制。[方法]通过酶消化法体外分离培养处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞;建立SHED与破骨前体细胞(外周血单个核细胞,peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的间接共培养模型,共培养3、7、10、14天。利用TRAP染色观察PBMCs向破骨细胞样细胞分化后的细胞数目与形态,利用实时定量RT-PCR和Western blot技术检测破骨相关基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6的表达,以评估PBMCs向破骨细胞样细胞分化的情况。在间接共培养模型中加入0、5、10、50、100ng/mL 不同浓度的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),通过实时定量RT-PCR和Western bolt检测破骨相关基因及核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路相关基因的表达。利用TNF-α(10ng/mL)模拟炎症微环境,利用BAY11-7082抑制NF-κB信号通路,检测RANKL/OPG以及NF-κB相关基因在SHED受到炎症微环境作用后的变化。[结果]与PBMCs单独培养组相比,在SHED与PBMCs间接共培养模型中,TRAP染色阳性、具有多个核的破骨细胞样细胞数量显著增多,破骨相关基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6在PBMCs中的表达水平显著上调。在一定浓度TNF-α刺激下,破骨相关基因CTSK、TRAP在PBMCs中的表达水平显著上调;RANKL、RANKL/OPG比值、细胞胞浆内p-IκBα和胞核内p65在SHED中的表达水平显著上调。在TNF-α刺激的同时加入BAY11-7082后,破骨相关基因表达水平下调。[结论]SHED能够促进破骨前体细胞向破骨细胞样细胞分化。在炎症微环境影响下,SHED的促进破骨细胞形成能力增强,;TNF-α能活化NF-κB信号通路,上调NF-κB相关基因的表达,通过调节RANKL/OPG的表达增强SHED的促进破骨细胞形成能力,这可能促进了牙根吸收导致乳牙生理性脱落。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R333.1
【部分图文】：

细胞形态,细胞团

２．１邋ＳＨＥＤ原代分离、培养、纯化逡逑乳牙牙髓组织通过酶消化法分离得到原代细胞，培养７天后可见多个克隆样的逡逑细胞团形成，细胞贴壁生长，具有多形性，呈短梭形、多角形等形状（图１Ａ）。逡逑通过有限稀释法挑选单个细胞，培养１４天左右时，镜下可见多个细胞团汇集成片，逡逑细胞排列似漩涡、束状，此为纯化的形态均一的ＳＨＥＤ邋（图１Ｂ）。逡逑２１逡逑

克隆形成,间充质干细胞

Ｂ：纯化培养后细胞聚集成片似漩涡（倒置像差显微镜，ｘ邋１0０）逡逑２．２邋ＳＨＥＤ间充质干细胞特性的鉴定逡逑经过１４天的成骨诱导后，可见大量红染的矿化结节（图２邋Ａ、Ｂ）；经过１４天逡逑常规培养，可见蓝染的克隆形成单位（图２邋Ｃ、Ｄ）；经过２８天的成软骨诱导后，逡逑实验组可见蓝染的粘多糖（图２邋Ｅ）；经过１４天成脂诱导后，细胞在镜下可见脂滴逡逑形成（图２Ｆ）；流式细胞分析仪结果显示，ＳＨＥＤ阳性表达了邋ＣＤ９０、ＣＤ１０５、逡逑Ｓｔｒｏ－１，而未表达ＣＤ３４、ＣＤ４５。以上结果表明ＳＨＥＤ具有间充质干细胞的基本特性逡逑（图邋３）。逡逑２２逡逑

表面抗原,流式细胞仪检测,像差,显微镜

＿邋＿逡逑图２邋ＳＨＥＤ多向分化及克隆形成逡逑：成骨诱导１４天，茜素红染色（倒置像差显微镜，ｘｌ00）；逡逑：常规培养１４天，克隆形成（倒置像差显微镜，ｘｌ00）；逡逑成软骨诱导２８天，阿利辛蓝染色（倒置像差显微镜，ｘ２00）；逡逑成脂诱导１４天，油红Ｏ染色（倒置像差显微镜，ｘ４00）逡逑Ｉ邋９９．６０％逦Ｔ邋９５．１０％—９．１０％逡逑

【参考文献】