CGRP抗体Fab片段的表达与PEG修饰工艺研究

发布时间：2020-09-10 09:17

　　 偏头痛是一种复杂的、由神经系统紊乱引发的、具有周期性、致残性、反复发作等特点的持续或间歇性头痛疾病,是继高位截瘫、精神分裂症、痴呆症之后的又一例被世界卫生组织列为严重影响患者工作和生活的致残性疾病,其严重性和影响力可见一斑。正因如此针对偏头痛的发病机制及治疗方法的研究也变得刻不容缓。随着数十年的研究和发展,偏头痛的发病机制由最初的“血管学说”转变为如今更为成熟、更具说服力的“神经学说”,并且逐渐发现和证实了降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-related Peptide简称CGRP)在引发偏头痛中的重要生理作用。自此之后,抗CGRP或其受体的单克隆抗体药物作为替代传统偏头痛治疗方式的新型治疗方法开启了偏头痛预防和治疗的新篇章。本研究以抗CGRP的抗体(Anti-CGRP antibody)Fremanezumab为基础,根据大肠杆菌密码子偏好性对其Fab(Fragment of antigen-binding)片段的基因序列进行优化并合成,利用本实验室建立的抗体Fab片段表达系统,基于实验过程中的具体问题进行优化,从最初的信号肽引导的周质分泌到优化后的培养基分泌,实现了Fab片段的高效可溶性表达,并且保证了Fab片段重轻链之间二硫键的正确形成。利用Protein L纯化介质对人抗体κ轻链的特异性结合的特点,对诱导表达后所得培养基进行初步亲和纯化,所得Fab产品相对于诱导菌液体积的产量约10 mg/L即诱导培养体积为1 L的菌液,处理纯化其培养基可得到约10 mg的Fab产品,并通过PhotoShop软件对Fab产品的SDS-PAGE检测结果进行灰度分析计算得出Fab纯度约60%。基于初次纯化纯度较低的问题,本研究采用了Nano SP阳离子交换介质进行二次精细纯化,所得产品经同样的分析方法得出Fab纯度达83%,并根据精细纯化前后Fab总量计算二次精细纯化后收率为62%。最终产品抗CGRP抗体Fab片段在下文中简写为ACFab。基于Fab片段分子量小、体内半衰期短等缺陷,结合蛋白质分子PEG修饰的原理和方法,本研究采用了Fab片段的定点PEG修饰即在Fab片段的重链末端引入半胱氨酸提供一个游离的巯基,经适当还原剂还原后与PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)在正交实验所得最佳条件下进行修饰反应,并对修饰后产物进行阳离子交换纯化获得纯度为97%的Fab-PEG修饰产物。最终采用非竞争性Elisa法检测ACFab及其PEG修饰产物的抗原抗体结合曲线和抗体亲和常数。其中ACFab亲和常数为(7.52±1.57)*10~7M~(-1)、ACFab-PEG修饰产物亲和常数为(2.90±0.25)*10~7M~(-1),由此确定了抗CGRP抗体Fab及其PEG修饰产物对抗原CGRP多肽的结合活性及能力,证明了本研究中ACFab原核表达纯化及PEG修饰方案的可行性,为后续的研究及ACFab的大规模生产奠定基础。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：

第一章 引言广泛应用[26]。其次有研究表明 CGRP 能够影响胶质细胞源性神经营养因子的分泌进而影响运动神经元；CGRP 还能促进神经再生，是一种对神经细胞具有较强调节保护作用的多肽[27]。随着对 CGRP 研究的深入以及对偏头痛发病机制的探索发现，CGRP 与偏头痛的发作也有一定的关系，并且逐渐被用作治疗偏头痛的新的靶点[28]。

图 1.2 CGRP 参与偏头痛的病理生理关系图[1]因此 CGRP 及其受体作为治疗偏头痛的新型特异性靶点，通过阻断 CGR与其受体结合的路径来治疗和预防偏头痛的新策略应运而生，各种 CGRP 受拮抗剂及抗 CGRP 及其受体的抗体药物的研发也成为近几年偏头痛临床治疗的热点[35]。尤其在 2018 年，CGRP 单克隆药物的研发取得了优异的成绩。其CGRP 与其受体结合过程及作用效果见图 1.3 所示，CGRP 抗体通过与突触后

图 1.3 CGRP 与其受体结合过程示意图[36] CGRP 抗体抗 CGRP 抗体在偏头痛治疗中的作用的预防治疗偏头痛的方法几乎都不是针对偏头痛而研发的，往往故而传统疗法在特异性和病人的耐受性方面都不能让人满意[37-38，偏头痛是一种中枢神经系统紊乱疾病，其中起关键作用的就是的活化和敏化反应，而三叉神经系统的刺激导致了神经肽尤其是关肽的释放，同时 CGRP 也被确认为偏头痛发作的诱发因子和增CGRP 被确定为偏头痛的靶点后，也展开了对 CGRP 受体的鉴定， 及其受体功能阻断的偏头痛新型治疗方法[40]。最初出现的是一种 C剂，CGRP8-37[41]。在 CGRP8-37的功能得到肯定后，Doods[42]等人相

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本文编号：2815650