金黄色葡萄球菌转录因子SarX蛋白及裂殖酵母邻苯二酚氧甲基转移酶spCOMT的结构和功能研究

发布时间：2020-09-10 14:29

　　 金黄色葡萄球菌是一种重要的机会型致病菌。该菌普遍存在于环境中,感染人体后,金葡菌通过分泌大量的毒力因子导致宿主机体器官被迅速破坏,引发脓疱病、毛囊炎、丘疹、疔疮、脓肿和烫伤样皮肤综合征等多种皮肤类病变,或造成肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、败血症以及中毒性休克综合症等严重系统性疾病,直至导致机体死亡。此外,金葡菌对外界抗生素、灭菌剂或其他不利于自身生长的条件具有较强的抵御和适应能力。随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等多重耐药金葡菌感染病例在全球逐年增多,金葡菌感染的临床治疗及新药开发面临越来越严峻的挑战。形成生物被膜是金葡菌感受到外界不利于自身生长信号时的主要防御方式。通过生成生物被膜,金葡菌进入接近休眠的持留菌状态,有效抵御人体免疫系统清除和灭菌剂渗入,使感染进入难以治愈的慢性状态;另外,持留菌状态还给予金葡菌足够的时间来获得新的抗性基因,最终进化形成MRSA等多重耐药型菌株。生物被膜形成及其调控机制的研究现已成为金葡菌治疗领域的急迫需求之一。金葡菌的生物被膜形成受全局调控因子、双组份调控系统和小非编码RNA三类调节因子的共同调控。其中,全局调控因子SarA家族成员SarX蛋白可以通过影响ica系统及agr系统的转录,调控生物被膜形成。SarX蛋白可以通过抑制ica的抑制子icaR蛋白间接激活ica,促进生物被膜主要成分PIA的合成,帮助生物被膜形成。SarX还可直接抑制agr转录,降低一百多种金葡菌胞外蛋白和毒力因子表达,同时推动生物被膜形成。但目前研究仅发现SarX可以与agr的promoter区直接结合,其结合位点、结合方式等尚不清楚;该蛋白调节agr转录的分子机制也仍是一片空白。在本论文的第一部分研究工作中,我们以金葡菌SarX蛋白为研究对象,采用DNase Ⅰ酶解足迹法和凝胶阻滞实验在agr promoter区找到了两段长度为21 bp的SarX特异性结合位点,并发现该结合过程中会出现多迁移条带现象。为阐明上述结合过程的分子机制,我们采用X-射线晶体学的方法解析了2.0A分辨率的SarX蛋白结构。SarX蛋白整体结构与大多数SarA家族成员类似,在大面积的疏水作用力和氢键的作用下,两个SarX单体组成一个“V”型的同源二聚体。使用化学交联的实验方法,我们确定了这种晶体结构中的同源二聚体也同样存在于溶液状态中,SarX以同源二聚体的形式发挥功能。通过SarX蛋白突变体的凝胶阻滞实验,我们确定了该蛋白“V”型二聚体分子的凹面负责与DNA结合。通过原子力显微镜的实验手段,我们直接观察了 SarX与agr promoter的相互作用情况,并发现在高浓度SarX蛋白条件下,SarX会与agr promoter DNA形成核酸蛋白纤维。在上述生化及结构工作基础上,我们使用分子对接方法得到了SarX与B型dsDNA之间可能的相互作用模型,提出了这种核酸蛋白纤维形成过程在agr转录调控过程中的可能机制。甲基化是生物体内广泛存在的一类生化反应,其生物功能非常广泛,包括:生物合成、代谢调节、解毒作用、信号传导、蛋白修饰、核酸修饰等。与种类繁多的甲基化底物相对应,自然界中进化出了各式各样的甲基转移酶,邻苯二酚氧甲基转移酶(COMT)便是其中一类。在哺乳动物中,邻苯二酚氧甲基转移酶被认为与情绪、认知、对压力的反应以及疼痛感知等生理现象有关,且是一个重要的药物设计靶点。在植物及细菌中,这类酶则负责部分主要代谢产物和次级代谢产物的合成。一直以来,真菌COMT的研究相对较少,但近年来发现裂殖酵母邻苯二酚氧甲基转移酶spCOMT不同于其他同源物,可同时存在于细胞质和细胞核中。这种特殊的细胞定位暗示细胞核中也存在该酶的天然底物。对spCOMT的深入研究将有助于我们发现该酶在细胞核内执行的生物学功能。在本论文的第二部分研究工作中,我们以裂殖酵母邻苯二酚氧甲基转移酶spCOMT为研究对象,首先在体外以七叶亭(esculetin)为底物验证了该酶的酶学活性及其催化活性对Mg2+的依赖性。通过X-射线晶体学方法解析了2.2A分辨率的spCOMT单体结构和2.0A分辨率的spCOMT-SAM复合物结构。结合上述结构信息和突变体等温量热滴定实验,我们发现spCOMT甲基供体SAM结合口袋的氨基酸残基具有组成特异性,单个位点的残基突变即可使其结合SAM的能力接近消失。我们推测这一特点可能与结合SAM时需要同时固定其甲硫氨酸、腺嘌呤和糖环三个部分有关。此外,我们还发现在spCOMT结合甲基受体的底物口袋中,与邻苯二酚头部结合的区域在同源蛋白中高度保守,但其口袋边缘部分长度更长、柔性更强,提示spCOMT的天然底物可能是一类含邻苯二酚头部和可变尾部长度的分子。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R378.11
【部分图文】：

是一个多次跨膜蛋白，被推测与ＰＩＡ向细胞膜外的运输相关［３２，邋３５］。由／0？系统逡逑控制合成的ＰＩＡ被认为是生物膜形成时菌体附着的主要贡献者［３６］，因此／ｃａ系逡逑统被认为是生物被膜合成的重要调控因子（图１．２）。逡逑３逡逑

￣逡逑Ｐｏｔｙ／＾ｃｖｔｙｌｇｌｕｃｏＭｉｎｂｎ邋（ＰＮＡＧ｝逡逑图１．２邋Ｗ操纵子合成ＰＩＡ／ＰＮＡＧ示意图逡逑注：左图中ｉｃａＡ、ｉｃａＤ、ｉｃａＣ和ｉｃａＢ蛋白分别使用不同颜色形状代表。该图片引用自Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ逡逑Ｙ．Ｌｅ邋等［３７］。逡逑ＳａｒＡ家族包含多个成员，目前研宄最清楚的是其家族代表：ＳａｒＡ蛋白。ＳａｒＡ逡逑蛋白被发现可以促进ｂｉｏｆｉｌｍ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂａｐ）的转录［３８］，由于Ｂａｐ被认逡逑为在生物被膜形成的最初粘附和细胞积累过程中起到重要作用［３９］，因此ＳａｒＡ可逡逑以促进生物被膜的形成。除此之外，ＳａｒＡ蛋白还被发现可通过对核溶解酶和蛋逡逑白溶解酶的抑制，促进菌体的附着和早期生物膜的形成［４０］。根据报道，转逡逑录本在形成生物被膜的菌体中明显增加［４１］；而在基因缺陷的金葡菌中生物逡逑被膜形成能力明显减弱［４２］。更多关于ＳａｒＡ家族成员对生物被膜调节的描述将逡逑在下个章节中展开。逡逑Ｊｇｒ是一个信号转导系统，该系统由Ｐｅｎｇ邋ＨＬ等首次报道［４３］。可编码逡逑ＲＮＡＩＩ邋和邋ＲＮＡＩＩＩ邋两个分子［４４］（图邋１．３），其中邋ＲＮＡＩＩ邋由邋Ｐ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋起始，ＲＮＡＩＩＩ逡逑由Ｐ３邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ起始。ＲＮＡＩＩ负责编码ＡｇｒＡ、ＡｇｒＣ、ＡｇｒＤ和ＡｇｒＢ四个蛋白

ＲＮＡＩＩＩ的３’端结构域被发现可以在指数后期抑制金葡菌表面的一些分泌蛋白的逡逑表达，进而抑制生物被膜的形成［６４］。ＲＮＡＩＩＩ的１端结构域调控目标基因的原理逡逑如下图１．４所示。逡逑ＲＮＡＩＩ逡逑Ｔ逦…？一逦ｒ逡逑０邋ｆ逦ｉ逦ｙｒ逦Ｉ逦ＲＮＡ＂丨逦１邋二＂ＳＵ逡逑．Ｈ邋ａ邋Ｔ逦个逦，逦＋逦１邋Ｕ２３Ｓ３邋（ＳｍＡ－ＨＭ逡逑ＭｆＯＯＯ／ｍｐ？邋ｍＡＮＡｓ逦Ｈｂｏ？ｏｍ？逦ＲＮａ？？邋ｉＨ逦Ｆｕｒｔｈｅｒ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ逦Ｉ逦ｉＰｒｏｔ？？ｎ邋Ａ）逡逑ｉ逦Ｎ逦Nｚ逡逑Ｍ，ｉＨ－邋ｎｎｒ邋ｉｎｒ逡逑，Ａ逦ｙ邋＾逦ｆ｜ｊ逦——？逦ｆｉｇ逦N逡逑＾逦ｆｔ逦－邋ｆｉｔ逦＊ｐＭ／＾Ｓ？ｒｔｒ？ｅｐｒｏｔｅ＊？？？）逡逑Ｉｌｆ逦ｉ逡逑Ａ邋？邋ｕ逦丨“逦Ｈ逦逦邋—ｉＭ邋？？0－■■■■邋ｂ逡逑ｒｏｔ邋ｍＲＭＡ逡逑图１．４邋ＲＮＡＩＩＩ３端非编码ＲＮＡ调控示意图逡逑注：图中分别为ＲＮＡＩＩＩ３＇端与目标ｍＲＮＡ以一个或两个ｌｏｏｐ环互补配对，导致扩展出一段逡逑不规则双链，这种结构将抑制核糖体的结合并使ＲＮａｓｅｌｌｌ对其进行降解，最终抑制相关基逡逑因的表达。该图片引用自ＳａｎｄｒｉｎｅＢｏｉｓｓｅｔ等［６４］。逡逑１．３全局调控因子ＳａｒＡ家族逡逑全局调控因子ＳａｒＡ家族是金葡菌生物被膜形成过程中一类重要的调节因子。逡逑该家族中的典型代表ＳａｒＡ蛋白是金葡菌中的一个转录因子，其被发现可以通过逡逑与被调控基因启动子区域的结合来调节这些基因的转录。根据现有报道，ＳａｒＡ蛋逡逑白可以对纤维连接蛋白结合蛋白Ａ／Ｂ邋（ｆｎｂＡ／ｆｎｂＢ）和毒素蛋白（ａ

【相似文献】

相关博士学位论文 前1条

1 王晴;金黄色葡萄球菌转录因子SarX蛋白及裂殖酵母邻苯二酚氧甲基转移酶spCOMT的结构和功能研究[D];中国科学技术大学;2019年

本文编号：2815929