人胚胎干细胞向多巴胺前体细胞的分化研究

发布时间：2020-09-10 20:18

　　人口老龄化会面临各种退行性疾病的高发。其中,神经系统的退行性疾病占有很大的比例。本课题主要围绕帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的细胞疗法展开研究,为之后研究中脑DA神经元的发育路径,PD发病机制和开展PD的细胞疗法奠定了坚实的基础。PD的发病机制主要是中脑黑质(substantia nigra pars compacta,SNc)区域DA神经元的死亡导致多巴胺(dopamine,DA)分泌量减少。开展PD的细胞治疗,最重要的是要得到源源不断的供体细胞,即DA神经前体细胞。本课题主要研究目标是建立DA神经元的分化体系,为PD的细胞疗法提供细胞。采用的策略是将人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)定向分化为DA前体细胞从而得到供体细胞。首先,通过添加特定组合的因子将hESCs诱导分化为神经底板细胞(neural floor plate cells,NFP),这部分细胞能够表达神经底板细胞的标志物LMX1A,FOXA2,OTX2。然后,经过FGF8等因子的诱导,神经底板细胞能够分化为DA前体细胞,这些细胞能够表达中脑的标志物LMX1A,FOXA2,EN1。我们将其体外培养发成熟为多巴胺神经元后,它能够表达成熟DA神经元的标志物TH,TUJ1。为了探究不同hESCs的分化潜力是否存在差异,我们采用了12株hESCs进行了DA的分化。实验结果证明,不同hESCs分化产生的DA神经前体细胞的效率是不同的,并筛选出了一株DA分化潜力较高hESCs,为DA的分化提供种子细胞。目前建立的DA神经元的化体系仍有不足之处。第一个不足之处是:DA前体细胞的标志物LMX1A的表达比例过低。通过查阅文献发现LMX1A在发育上是由WNT通路调控的,而CHIR99021是WNT通路的激活剂,所以我们利用了H9-LMX1A的报告细胞系对CHIR99021的最适浓度进行了筛选,进而上调LMX1A的表达水平。第二个不足之处是试剂不符合临床要求。由于基础级B27中含有BSA成分,我们更换为临床级B27。实验结果证明临床级B27可以较好的取代基础级B27。第三个不足之处是DA神经元的分化效率较低。本课题使用两种方法来提高DA神经元的分化效率。一种提高效率的方法是通过延长两种营养因子GDNF和TGFβ3的作用时间来为DA神经元提供分化所需的营养物质,进而提高LMX1A,FOXA2,EN1,TH,TUJ1的表达比例。另一种方法是在ES细胞诱导分化为神经细胞的过程中,通过降低高SHH的浓度,同时加入SHH的激活剂PP来增强腹侧化程度来提高DA神经元的分化效率。从分化成本上看,SHH是一种蛋白质,价格较贵,这样也可以减少DA神经元的分化的成本,这为后续大量提供DA细胞治疗PD提供了很大的帮助。综上所述,本课题主要包括三个部分:DA神经元分化体系的建立,不同hESCs向DA分化潜力的差异性研究,DA神经元分化体系的优化。这不仅为PD的细胞治疗提供了充足的供体细胞,还为DA分化体系的优化提供了宝贵经验。
【学位单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

多巴胺神经元,未成年

帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是一种中枢神经系统发生退行性病变的一类疾患者会出现身体震颤、肌肉僵直、身体姿势不能保持平衡等的运动症状和嗅觉发生便秘、睡眠行为和精神方面异常等的非运动方面的症状，严重影响了患者的工作和生1.2 发病机制多巴胺神经元主要分布于嗅球到中脑的区域（图 1.1）。中脑区域的多巴胺神经元有三群，分别位于红核后区（A8），黑质致密部（substantia nigra compacta pars，SN（A9），腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTN）（A10）[38]。其中位于的神经元，主要投射到背外侧纹状体的尾状核和壳核，其退行性病变将导致 PD[3]。SNc 区域的神经元发出的上行纤维投射到纹状体，形成黑质—纹状体通路并分泌和释放多巴胺，区域病变是造成帕金森症的直接原因。VTN 区域的 DA 神经元投射至伏隔核的边缘形成中脑边缘叶通路，它的过度活跃与精神分裂症及药物成瘾有关。红核后区 DA 神投射至大脑前额叶皮层，与情绪和动机有关。

多巴胺神经元,策略,中脑

6图 1.2 多巴胺神经元的分化策略[28]Figure1.2 Protocols for the differentiation of mDAneurons.[28]多项研究证实，只有中脑区域特异性神经细胞可以在移植部位很好的生存并起功能，杂质细胞会影响 TH+神经元数量和行为改善效果。而且，EN1+的中脑特异多巴胺神经细胞移植后在体内所生成 TH+神经元的数量、体积及密度都是最佳的。因此，EN1 作为中脑黑

再生医学,新方法,策略

一定可以实现这一目的，帕金森病这类由特定细胞病变引起的疾病将能通过细胞替代得到有效治疗。由于前述临床级干细胞、功能性 DA 神经元获得技术取得重要进展，临床级别条件分化的 DA 神经元在啮齿类和非人灵长类 PD 模型中显示出令人鼓舞的结果，基于临床级干细胞分化的 DA 神经元移植治疗帕金森病的临床试验条件已经成熟[17,29]。但是，这种治疗方法的推广和普及尚面临一定的问题，需要大量的临床前和临床研究对细胞治疗的安全性和有效性进行全面评价。1. 细胞移植能否成为常规由于帕金森病的发病部位的特殊性和行使功能的重要性，治疗上存在许多困难。要用细胞移植的方式治疗帕金森病，需要通过神经外科手术将细胞递送到纹状体区，特别是豆状核的壳部。因此，即使干细胞治疗的安全性和有效性得到充分的验证，如何进一步优化细胞治疗的途径，尽可能减少手术创伤，是有效推动细胞移植治疗广泛应用于临床的重要前提之一。2. 哪种细胞来源更可能用于移植针对退行性变的细胞替代治疗，将来主要会面临着两种选择（图 1.3，图 1.4），是用胚胎干细胞分化的 DA 神经元，还是用自体细胞进行重编程或转分化获得个性化的 DA 神经元进行移植。

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