PIM2在人类红系发育中的功能研究

发布时间：2020-09-11 08:13

　　研究背景和目的:红系发育是指造血干细胞在造血微环境中分化为成熟红细胞的全过程。这一过程大致可分为红系发育早期阶段、红系发育终末阶段和网织红细胞成熟三个阶段,并伴随着一系列独特的变化,包括细胞体积的减小、血红蛋白合成增加、染色质固缩以及脱核等。因此,红系发育需要精细而复杂的调控。既往对红系发育的分子调控机制研究主要集中在促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受体(Erythropoietin receptor,EPOR)、糖皮质激素及其受体、转录因子GATA1、GATA2及KLF1等和表观遗传修饰如小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)、DNA甲基化以及乙酰化修饰等方面。但关于激酶在这一调控过程的研究仍较少。PIM2(Proviral Integrations of Moloney virus 2)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,在多种肿瘤的发生和发展中起到重要的抗凋亡和促进增殖的作用,而其在人红系发育中的作用尚不明确。为了研究其功能,我们利用shRNA敲低技术在人CD34~+造血干细胞阶段敲低PIM2的表达并定向红系分化,检测其在红系分化过程中的作用。同时,为了观察PIM2在K562、HEL和TF1这三种血液恶性肿瘤细胞系中的功能,我们利用相同的方法敲低PIM2的表达,并利用Hemin诱导其向红系分化,检测在此过程中PIM2对血液恶性肿瘤细胞系向红系分化进程的影响。课题的完成将有助于阐释PIM2在正常生理及疾病过程中的作用及潜在的分子机制。研究方法:利用RNA-seq分析PIM2在胎肝来源、外周血来源及脐带血来源的CD34~+细胞定向分化的红系各期细胞的表达谱,并利用qRT-PCR和Western Blot的方法验证PIM2在脐带血CD34~+细胞定向分化的红系细胞中的表达;利用脐带血CD34~+造血干细胞培养巨噬细胞、粒细胞等,利用qRT-PCR检测PIM2的表达。为了研究PIM2在红系发育过程中的作用,我们设计了可敲低PIM2表达的shRNA,在脐带血CD34~+造血干细胞阶段敲低PIM2的表达,定向红系分化;利用qRT-PCR和Western Blot检测敲低效率,流式细胞术检测红系早期分化、终末分化、增殖、周期、凋亡以及脱核等;细胞计数检测红系细胞的增殖、Cytospins观察不同培养天数的红系细胞形态的改变。在检测的过程中细胞出现了明显的凋亡现象,进一步利用AO-EB染色确认细胞凋亡。根据PIM2敲低后凋亡明显增加的表型我们运用流式细胞术检测P53的蛋白表达水平以及qRT-PCR检测P53下游基因BAX和P21等的表达以及调控P53蛋白稳定性的MDM2的表达。Western Blot验证P53及其下游P21和BAX的表达。利用相同的方法,在K562、HEL和TF1这三种血液恶性肿瘤细胞系中敲低PIM2的表达。利用流式细胞术、联苯胺染色等方法,探究PIM2敲低对这三种细胞系的增殖、分化以及凋亡的影响。结果和结论:RNA-seq结果显示PIM2在胎肝来源、外周血来源以及脐带血来源的CD34~+造血干细胞定向红系分化的各期细胞中的表达均是逐渐升高,在Ortho-E期的表达均是最高的。qRT-PCR和Western Blot结果显示PIM2的mRNA和蛋白水平在脐带血CD34~+造血干细胞来源的红系细胞分化中表达逐渐升高。qRT-PCR结果显示Ortho-E期PIM2的表达均高于常见的血液系统细胞和其他常见人类细胞。细胞计数和流式结果显示PIM2敲低不影响早期红系分化和增殖,显著延迟终末红系分化。与对照组相比,敲低组终末红系细胞的数目降低超过2倍,G0/G1期升高了约15%,敲低组的S期与正常组比较降低了约10%,凋亡细胞比例增加超过2.5倍。此外,PIM2敲低还导致红系细胞的脱核比例明显下降。利用流式细胞术我们发现P53的蛋白表达升高超过2倍。进一步利用qRT-PCR检测P53的mRNA表达以及其下游基因BAX、P21、BAK和NOXA的表达,我们发现PIM2敲低导致P53下游基因表达水平均增加3倍以上,但不影响P53 mRNA的表达。Western Blot结果进一步显示PIM2敲低后导致P53及其下游P21和BAX的表达明显升高。MDM2可以降解P53蛋白,进一步我们利用qRT-PCR检测发现MDM2的表达下降超过50%。PIM2敲低对K562细胞增殖、分化以及凋亡无明显影响。对HEL细胞分化有抑制、对细胞的凋亡和增殖无影响。对TF1细胞的增殖和凋亡无影响但促进了细胞的分化。PIM2敲低在正常红系发育中具有阶段性调控作用,对早期红系细胞增殖以及分化无明显影响,对终末红系细胞增殖、分化和脱核起到重要的调控作用;其中PIM2敲低导致终末红系细胞凋亡的主要原因可能是激活了P53介导的内源性凋亡信号通路;与此同时PIM2敲低对恶性血液肿瘤细胞系向红系分化时细胞增殖和凋亡无明显影响。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

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不但能够维持红细胞独特的双面凹陷的圆盘形状，使其能够以最大限度地从周围的环境中摄取足够的氧气的功能，而且赋予了红细胞强大的柔韧性和变形能力，这些均为红细胞行使运输氧气提供了强大的生理功能保障。与此同时，红细胞中含有大量丰富的血红蛋白，这种红细胞特有的蛋白能够结合在肺部与氧结合形成氧合血红蛋白，是红细胞能够携带氧气的物质基础之一[3,4]。红细胞的生成是个复杂的过程，经历了多能干细胞向红系分化和红系祖细胞的继续分化直至发育成熟等过程。红系发育是造血发育的重要分支，主要可分成三个阶段：1、早期发育阶段：主要指从造血干细胞发育生成 BFU-E 和 CFU-E的阶段；2、终末分化阶段：主要是指从形态上可分辨的原始红细胞经过早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞，进而脱核生成网织红细胞的过程；3、网织红细胞成熟阶段：网织红细胞进入血液循环逐渐成熟[5]。其中早幼红细胞阶段便可产生具有携氧功能的血红蛋白，而晚幼红细胞阶段主要发生的事件是细胞核的脱出。血红蛋白的生成以及细胞核的排出是红细胞分化并逐渐走向成熟的重要标志，见图 1.1。

示意图,亚型,蛋白,示意图

图 1.2 PIM 蛋白亚型示意图（引自：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/med.21284）人的 PIMs 激酶也是彼此高度同源：在氨基酸水平上，PIM2 和 PIM1 53%是相同的，而 PIM2 和 PIM3 有 65%的同源性，三个 PIM 激酶的一些功能冗余在体外[10,11]和体内[12,13]已被证明。已经有报道称 PIM1 和 PIM2 的翻译起始位点不同，产生了具有不同分子量的亚型。PIM1 激酶编码 34kDa 和 44kDa 同种型，但这两种型的激酶活性是相同的。PIM2 以三种同种型(34kDa、37kDa 和 40kDa)存在，但是对它们三个蛋白质功能或相互作用的差异并没有很多的解释和讨论。PIM3仅为单一的同种型。PIM 激酶亚型普遍表达，但具有一些组织特异性：PIM1 在造血细胞、胃、头颈部和前列腺肿瘤中有高表达。PIM2 在淋巴和脑组织中表达很高；PIM3 在乳腺癌、肾癌和脑组织中高表达。1.2.2 PIM2 调节的信号通路PIM 激酶的表达不仅受到不同类型的调控因子所控制，而且还受到转录水

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图 1.3 PIM 蛋白激酶激活模式图（引自：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006-2952(12)00649-1）PIM2 基因是作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前整合位点最早被发现的。小鼠的 PIM2 基因首先被我们克隆出来，接着人、青蛙、牛、老鼠以及斑马PIM2 基因也被逐一的克隆出来[15,16]。根据 PIM2 基因的特性，PIM2 编码的是一种高度保守的丝/苏氨酸激酶，PIM2 基因的表达水平不仅仅是受到激素胞因子和分裂素等这些非自身条件的影响，同时也受到其自身转录水平的录后水平的、翻译水平的以及翻译后水平的自身因素的影响，就目前以上表明 PIM2 蛋白和大部分的细胞功能如其凋亡、增殖、分化和肿瘤发生以及发展均是紧密关联的[17]。随着人们对肿瘤发病学不断深入的研究，丝/苏氨酶 PIM2 在如何抑制肿瘤细胞凋亡的机制这方面得到有越来越多的关注。通较与不同癌基因作用和 PIM2 的作用机制，我们发现，PIM2 具有强大而广抗凋亡作用，虽然目前仅仅对 PIM2 作用的机制作了初步的判断，但仍可以后 PIM2 的研究提供一些思路。

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