细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌构建及其免疫原性研究

发布时间：2020-09-11 13:05

　　 目的:构建表达细粒棘球绦虫EgM123的重组耻垢分支杆菌,将该疫苗通过prime-boost免疫策略接种BALB/C小鼠,确定重组活载体疫苗是否可以延长免疫周期,是否对基础免疫起到增强的作用,及其诱导的体液免疫和细胞免疫,为囊性包虫病保护性疫苗的研究提供证据。方法:(1)扩增EgM123蛋白编码基因,将该基因片段插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建pMV261-EgM123重组质粒,用电穿孔的方法将重组质粒转化耻垢分枝杆菌,构建成rMS-EgM123重组疫苗。(2)经过不断的克隆过程观察重组质粒pMV261-EgM123在耻垢分枝杆菌中能否稳定的存在。在rMS-EgM123的培养过程中,连续的检测菌液的OD值,绘制出细菌的生长曲线。(3)通过热诱导的方法诱导目的蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白。(4)通过不同的免疫途径和剂量接种BALB/C小鼠,通过不同的接种组合,用单次接种和加强免疫接种等方式接种BALB/C小鼠,分别在免疫后0周,2周,4周,5周,6周,7周,8周收集血清,并在第8周处死小鼠,分离小鼠肠粘膜,检测血清和肠粘膜中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平。(5)分离脾脏细胞用流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞和B淋巴细胞的百分率。(6)用Q-PCR定量检测脾脏中TNF-α,IFNγ,IL-4,IL-10,等因子的表达。(7)通过对各组小鼠小肠进行组织染色,探究接种重组耻垢分枝杆菌疫苗后对小鼠肠黏膜免疫的影响。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳显示EgM123(596bp)编码基因扩增成功,片段大小符合设计长度。(2)重组质粒pMV261-EgM123经过PCR扩增、双酶切以及基因测序证明为正确表达阅读框架。(3)我们含有重组质粒rMS-EgM123的耻垢分枝杆菌连续克隆传代10代后,测序结果表明在经过10代传代后重组质粒pMV261-EgM123能在耻垢分枝杆菌没有变异;rMS-EgM123的生长曲线和耻垢分枝杆菌的生长曲线保持一致。(4)SDS-PAGE显示重组耻垢分枝杆菌rMS-EgM123表达量较低,没有看到特别明显的表达条带,但Western blotting证实该蛋白能特异性的与抗EgM123血清起反应。(5)通过不同的免疫策略接种小鼠,我们发现,rMS-EgM123可以用于加强免疫,用rMS-EgM123加强免疫后,小鼠血清抗体呈现一个持续上升的趋势,而只有蛋白作为基础免疫组(EgM123/PBS)小鼠抗体水平在经过短暂的上升后就开始持续性的下降,单次免疫rMS-EgM123组小鼠血清中持续检测出较低水平的抗EgM123抗体,而接种了空载耻垢分枝杆菌MS的小鼠血清中检测不到特异抗体。(6)抗体亚类的检测显示,加强免疫组(EgM123/rMS)和蛋白基础免疫未加强组(EgM123/PBS)小鼠血清中主要以IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3为主,没有检测到IgA的生成;加强免疫组IgG2b抗体水平要高于未加强免疫组,其余亚类两者之间没有明显的统计学差异;而单次免疫rMS-EgM123(rMS)则产生了较弱的IgG1和IgG2b。在肠粘膜中,加强免疫组(EgM123/rMS)产生了较高水平的IgG1、IgG2a和IgG2b;而未加强免疫组(EgM123)产生了较高水平的IgG2a和IgG2b;有趣的是,rMS-EgM123组则产生了IgA。(7)免疫接种后,小鼠脾脏B细胞所占的比率要高于正常组,而T淋巴细胞和T细胞亚群的百分含量均无差异。单独免疫了rMS和MS组小鼠脾脏淋巴细胞中,B淋巴细胞和T淋巴细胞所占脾脏淋巴细胞比值低于正常组小鼠,而在T细胞亚群分类中,这两组小鼠脾脏CD4+T细胞在免疫后高于正常组,两组小鼠脾脏CD8+T细胞则要低于正常组。(8)小鼠小肠组织HE染色可以看出,EgM123/rMS组小肠绒毛膜呈现出不同程度的锯齿状,绒毛膜周围有较多的细胞侵润。(9)用不同策略免疫后小鼠脾脏Th1和Th2细胞因子表达没有明显的改变。结论:重组耻垢分枝杆菌rMS-EgM123能在体内外表达EgM123抗原蛋白,且能作为BOOST疫苗加强基础免疫刺激机体产生的体液免疫,也能在一定程度上增强机体细胞免疫水平,对小肠粘膜保护性免疫也有一定的作用。可以将rMS作为抗包虫病的候选疫苗。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R383.33
【部分图文】：

图 1-1 重组 rMS-EgM123 构建示意图Fig 1-1 The schematic diagram of the constraction of rMS-EgM123引物设计 Genebank 公布的 EgM123 基因序列（AAL96201.1）设计引物并加coRⅠ和 SalⅠ两个酶切位点。如下：引物 5’-- CATGAATTCATGGAACCAGTGAATTTTGCC--3’；引物 5’-- ACTGTCGACTTATTTCGTCTTTAAGGCACGAAAC--3’。海生工合成。ET28a-EgM123 模板质粒的提取

图 1-2. EgM123 基因 PCR 扩增产物M:DL2000 分子标准质量；1：EgM123 扩增产物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR product达载体 pMV261-EgM123 的克隆鉴定定：构建好的重组质粒 pMV261-EgM123 经过1％琼脂糖凝胶电泳后发现，重组质粒 pMV26bp，与目的基因 PCR 产物大小一致，进一步证

图 1-2. EgM123 基因 PCR 扩增产物M:DL2000 分子标准质量；1：EgM123 扩增产物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR products穿梭表达载体 pMV261-EgM123 的克隆鉴定粒 PCR 鉴定：构建好的重组质粒 pMV261-EgM123 经过 PC产物以 1％琼脂糖凝胶电泳后发现，重组质粒 pMV261-为 594bp，与目的基因 PCR 产物大小一致，进一步证实图 1-3

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本文编号：2816714