抗圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白纳米抗体的生物素修饰及二聚化改造

发布时间：2017-04-02 03:03

  本文关键词：抗圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白纳米抗体的生物素修饰及二聚化改造，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骆驼和部分鲨鱼体内能产生天然缺失轻链的重链抗体,克隆重链可变区可以获得只由VH组成的单域抗体,称之为纳米抗体。纳米抗体具有体积小、对环境的耐受性强、与抗原结合能力强及免疫原性低等特点,因此被广泛应用于医学上的诊断与治疗。本实验室把PCV2病原免疫骆驼,收集外周血淋巴细胞建立酵母文库,并通过酵母双杂交筛选,获得了21株针对PCV2 Cap蛋白的纳米抗体。通过原核表达及ELISA验证,发现有几株纳米抗体的活性优于商品化试剂盒里的血清。本研究基于以上基础,选取一株活性最好的纳米抗体做进一步的改造:通过一条柔性Linker的连接将此纳米抗体同源二聚化;通过引入翻译增强元件TEE来增强蛋白的表达;通过在纳米抗体的C端融合Avidin-tag,在表达生物素连接酶BirA的表达菌(外源添加bioin)中进一步实现了二聚化纳米抗体的生物素化。经过上述修饰改造,纳米抗体的活性得到了极大的提高。生物素-亲和素系统是近年来广泛应用的信号级联放大系统;通过将抗体同源二聚化可以有效提高抗体结合抗原的能力;通过翻译增强元件TEE可以进一步提高外源蛋白原核表达的效率,从而降低抗体生产的成本。因此,本研究可以为PCV2的病原诊断ELISA试剂盒提供优质廉价抗体,有较大的应用价值。
【关键词】：纳米抗体 生物素 同源二聚体
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文献综述9-22
• 第一章 纳米抗体简介及大肠杆菌表达系统的研究进展9-17
• 1.1 纳米抗体简介9-14
• 1.1.1 纳米抗体的结构特点9-11
• 1.1.2 纳米抗体的功能特性11-12
• 1.1.3 纳米抗体的应用12-14
• 1.2 大肠杆菌原核表达系统的研究概况14-17
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统表达外源基因的优缺点14-15
• 1.2.2 提高大肠杆菌表达系统高效可溶性表达外源蛋白的方法15-17
• 第二章 融合标签技术研究进展17-22
• 2.1 融合标签的种类17-18
• 2.2 融合标签的作用18-19
• 2.2.1 增加重组蛋白质的产量18-19
• 2.2.2 提高蛋白的可溶性和稳定性19
• 2.2.3 促进蛋白正确折叠19
• 2.2.4 实现蛋白的特异性标记19
• 2.2.5 在检测方面的应用19
• 2.3 生物素亲和素系统（BAS系统）19-20
• 2.4 本论文的研究意义、主要内容及技术路线20-22
• 2.4.1 研究意义20-21
• 2.4.2 主要内容及技术路线21-22
• 试验研究22-36
• 第三章 抗圆环病毒II型Cap蛋白纳米抗体的生物素修饰及二聚化改造22-35
• 3.1 材料22-25
• 3.1.1 PCV2 Cap蛋白、纳米抗体、菌株、载体22-23
• 3.1.2 酶、纯化树脂、抗体23
• 3.1.3 主要药品及试剂23
• 3.1.4 溶液配制23-25
• 3.1.5 主要仪器25
• 3.2 方法25-30
• 3.2.1 纳米抗体表达载体的构建25-26
• 3.2.2 重组纳米抗体的诱导表达及纯化26
• 3.2.3 包涵体的提取26-27
• 3.2.4 蛋白透析27
• 3.2.5 PCV2 Cap蛋白的表达纯化27-28
• 3.2.6 融合标签纳米抗体和Cap蛋白量的测定28-29
• 3.2.7 间接ELISA检测融合标签纳米抗体抗原结合活性29
• 3.2.8 直接ELISA检测重组纳米抗体生物素标记的效果29-30
• 3.3 实验结果30-34
• 3.3.1 PCV2 Cap的原核表达与纯化30
• 3.3.2 生物素化纳米抗体二聚体表达载体pNovoAvi-dVHH的构建30-31
• 3.3.3 生物素化纳米抗体二聚体的表达31-32
• 3.3.4 重组纳米抗体包涵体的提取与纯化32
• 3.3.5 重组纳米抗体的ELISA功能验证32-33
• 3.3.6 重组纳米抗体生物素标记ELISA验证33-34
• 3.4 讨论34-35
• 结论35-36
• 参考文献36-39
• 致谢39-40
• 作者简介40

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