牛血红蛋白单克隆抗体的制备及其检测试剂盒研制

发布时间：2017-04-02 01:08

  本文关键词：牛血红蛋白单克隆抗体的制备及其检测试剂盒研制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的制备抗牛血红蛋白(bHb)单克隆抗体杂交瘤细胞株,鉴定抗b Hb单克隆抗体(McAb)。建立双抗体夹心ELISA检测方法,以检测疫苗生产中小牛血清辅料中bHb的含量。方法以新鲜牛全血为原料,提取和纯化牛血红蛋白(bHb),以其作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合方法,筛选、克隆杂交瘤细胞株,制备抗bHb单克隆抗体;间接ELISA法检测McAb,免疫印迹鉴定McAb的特异性;用ProteinA亲和层析柱纯化单克隆抗体腹水中的抗bHb单克隆抗体,过碘酸钠法对抗体进行辣根过氧化酶标记。用不同株单抗分别作为包被相和检测相抗体组装试剂盒;优化包被抗体的包被浓度、时间及酶标抗体的工作浓度和时间;组装成定量检测bHb含量的双抗体夹心ELISA试剂盒,对试剂盒的稳定性、精密度和特异性及实际应用做了系统评价。结果用层析法提取出具有免疫活性的牛血红蛋白;经杂交瘤筛选技术,获得4株分泌特异性抗bHb单克隆抗体的杂交瘤:1A10,2A6,3F8和4C6,经过长期传代和反复冻融,细胞株仍能稳定表达特异性抗体。4株McAb腹水ELISA效价能达到1:106~1:108;4株单克隆抗体亚型为IgG1和IgG2a;相对亲和力3F84C61A102A6;表位鉴定结果显示4株McAb针对3个不同的抗原表位;以1A10和4C6作为包被抗体,3F8作为酶标记抗体,建立双抗体夹心ELISA方法,组装的试剂盒具有良好的稳定性、特异性和精密度,通过对疫苗生产中小牛血清辅料的检测,证明该ELISA试剂盒可以应用于小牛血清中牛血红蛋白含量的检测。结论成功提取纯化了牛血红蛋白抗原,通过单抗杂交瘤技术,制备出4株抗牛血红蛋白单克隆抗体,建立了稳定性好,特异性强的双抗体夹心ELISA方法,可以用于疫苗生产中血清辅料中牛血红蛋白含量的检测。
【关键词】：血清辅料 牛血红蛋白 单克隆抗体 ELISA
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 前言10-15
• 1.1 血红蛋白概述10-11
• 1.2 血红蛋白代谢及应用11-12
• 1.3. 单克隆抗体技术12-13
• 1.4 酶联免疫吸附测定(ELISA)13
• 1.5 本课题的研究意义13-15
• 第2章 实验内容15-42
• 实验一 牛血红蛋白的提取和纯化15-17
• 1.1 材料和方法15-16
• 1.1.1 实验试剂15
• 1.1.2 牛血红蛋白的提取和纯化15-16
• 1.1.3 提取牛血红蛋白纯度鉴定16
• 1.2 结果16-17
• 1.2.1 牛血红蛋白提取方法的确定16
• 1.2.2 提取牛血红蛋白的鉴定16-17
• 实验二 牛血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定17-28
• 2.1. 材料17-18
• 2.1.1 实验动物和细胞17
• 2.1.2 主要试剂17
• 2.1.3 主要设备17-18
• 2.1.4 培养基18
• 2.2 方法18-23
• 2.2.1 动物的选择18
• 2.2.2 动物免疫18
• 2.2.3 骨髓瘤细胞的准备18-19
• 2.2.4 饲养细胞的制备19
• 2.2.5 免疫脾细胞悬液的制备19
• 2.2.6 细胞融合的步骤19-20
• 2.2.7 阳性孔的筛选20
• 2.2.8 有限稀释法对阳性杂交瘤细胞的克隆化20
• 2.2.9 杂交瘤细胞株稳定性的分析20-21
• 2.2.10 腹水制备21
• 2.2.11 腹水及细胞培养上清效价的测定21
• 2.2.12 单克隆抗体的亚型分析21
• 2.2.13 Protein A-Sepharose CL-4B亲合层析纯化单克隆抗体21
• 2.2.14 单克隆抗体的相对亲和力测定21-22
• 2.2.15 单克隆抗体识别表位分析22
• 2.2.16 单克隆抗体的特异性分析22-23
• 2.3 结果23-26
• 2.3.1 细胞融合及筛选23
• 2.3.2 杂交瘤细胞株稳定性的分析23
• 2.3.3 腹水及培养上清效价的测定23
• 2.3.4 单克隆抗体的亚型分析23-24
• 2.3.5 单克隆抗体的纯化24-25
• 2.3.6 单克隆抗体相对亲和力测定结果25
• 2.3.7 单克隆抗体结合位点的分析25-26
• 2.4 讨论26-28
• 2.4.1 动物免疫26
• 2.4.2 细胞融合26-27
• 2.4.3 筛选和克隆化27
• 2.4.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏27-28
• 实验三 牛血红蛋白ELISA检测试剂盒的组装28-42
• 3.1. 方法28-31
• 3.1.1 酶标反应板均一性的测定28
• 3.1.2 抗牛血红蛋白单克隆抗体的辣根过氧化物酶（HRP）标记28-29
• 3.1.3 酶标单克隆抗体反应浓度的确定29
• 3.1.4 单克隆抗体包被浓度的确定29
• 3.1.5 单克隆抗体包被条件的确定29
• 3.1.6 封闭液的选择29-30
• 3.1.7 封闭条件的确定30
• 3.1.8 酶标单抗反应时间的确定30
• 3.1.9 双抗体夹心ELISA操作步骤30-31
• 3.1.10 特异性检测31
• 3.1.11 稳定性试验31
• 3.1.12 精密度31
• 3.1.13 试剂盒的应用31
• 3.2. 结果31-39
• 3.2.1 酶标反应板均一性的测定31-32
• 3.2.2 抗牛血红蛋白单克隆抗体的辣根过氧化物酶（HRP）标记32
• 3.2.3 酶标抗体反应浓度的确定32-33
• 3.2.4 单抗包被浓度的确定33-34
• 3.2.5 包被条件的确定34-35
• 3.2.6 封闭液的选择35
• 3.2.7 封闭条件的确定35-36
• 3.2.8 酶标单抗反应时间的确定36-37
• 3.2.9 特异性检测37
• 3.2.10 稳定性检测37-38
• 3.2.11 精密度38-39
• 3.4. 讨论39-42
• 3.4.1 固相载体39
• 3.4.2 包被39
• 3.4.3 包被蛋白质39-40
• 3.4.4 酶结合物40
• 3.4.5 酶底物40
• 3.4.6 洗涤液与稀释液40-41
• 3.4.7 结果判断41-42
• 第3章 结论42-43
• 参考文献43-44
• 附录44-48
• 致谢48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：281611