造血干细胞发育中长链非编码RNA的功能研究

发布时间：2020-09-22 07:10

　　 造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)通常被认为是造血系统的基石,在生物体整个生命周期中具有持续产生所有成熟血细胞的功能,并能够完全重建成体的造血系统和免疫系统,是研究历史最长且最为深入的成体干细胞之一。HSC移植常用于临床治疗多种血液系统疾病、遗传性疾病、某些实体瘤和自身免疫性疾病等,具备较好的治疗效果。但是,由于HSC来源受限及体外扩增困难等问题使得很多病人失去了接受治疗的机会。为了解决这些问题,研究尝试利用多能干细胞定向诱导分化形成HSC,然而对于HSC发育的基本规律和调控机制缺乏系统性的科学认识,使得体外诱导HSC再生至今仍未成功。因此探索HSC的发生发育规律和调控机制就表现得尤为重要。在小鼠胚胎发育期第10.5天(embryonic day 10.5,E10.5),产生了第一个能够长期重建成体造血系统的HSC,它的起源包括卵黄囊(Yolk sac,YS)、头部和主动脉-性腺-中肾区(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)等多个血管位点。近年来研究发现其中最重要的生血位点AGM区的HSC是由生血内皮细胞经过内皮-造血转化(Endothelial-hematopoietic transition,EHT)的过程,然后产生Ⅰ型造血干细胞前体和Ⅱ型造血干细胞前体等两类造血干细胞前体(pre-hematopoietic stem cell,pre-HSC),并进一步发育成熟为HSC。并且,由于HSC发育时间窗持续时间有限,pre-HSC和HSC等这些发育过程中重要的细胞群体数量是非常稀少的,且缺乏有效富集这些细胞群体的特异性表面标志分子,这些特点使得探索HSC起源规律及解析深层次的调控机制显得异常困难。迄今为止,虽然有不少研究报道了小鼠胚胎期HSC发育中所参与的调控分子,但是已知的一些研究仅仅集中在信号通路及转录因子的调控作用,如转录因子Runx1(及其下游转录因子Gfi1和Spi1)、Gata2等对于内皮向造血转化必不可少;转录因子Hoxa3一方面通过抑制重要造血转录因子的表达,另一方面通过促进内皮细胞转录因子表达来维持内皮细胞的内皮特性,抑制内皮向造血转化;转录协同分子Smad4也同样被证实负调控了该过程。另外,信号通路如BMP/TGF-β、Notch、Wnt、TNF-α和Hedgehog在内皮向造血转化中都发挥着重要的作用。与研究相对透彻的编码基因和信号通路相比,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在HSC发育过程中的动态表达图谱及生理功能至今还没有报道。既往研究在国际上首次建立单个细胞的孵育诱导移植实验体系并通过大规模的筛选多种表面标志组合发现特异性表面标志CD201,并实现pre-HSC高达30%的精准捕获。同时结合单细胞转录组测序技术,系统揭示了HSC完整生命周期中相关群体的动态分子表达规律,实现了单细胞水平的精准研究。基于以上HSC发育全程单细胞转录组的高通量测序数据,本研究进一步经过系统性生物信息学分析,鉴定出该六种细胞群体里共有7312个lncRNA,首次描绘出HSC发育全程的单细胞lncRNA的动态表达图谱,并系统揭示了lncRNA在六个连续发育的细胞群体中的时空表达、与邻近蛋白编码基因相关性、阶段特异性基因等方面的表达特征,而且还通过与重要蛋白编码基因的基因座共定位或共表达来预测相关lncRNA的生理功能。Pearson相关性分析显示lncRNA与其邻近的第一个蛋白编码基因相关性最强,主成分分析(Principal components analysis,PCA)表明lncRNA比mRNA更易于区别不同时空相似的细胞群体,揭示在造血干细胞发育过程中lncRNA可能具有更强的阶段特异性,进一步提示lncRNA在整个过程中发挥了重要作用。同时,针对研究分析出的401个全新的未注释的lncRNA进行了PCR和Sanger测序并鉴定出了一系列真实存在于HSC发育过程中全新未注释的lncRNA分子,进一步证实lncRNA调控HSC发育的潜在重要功能。后续按照三个严格的生物信息学分析筛选标准筛选出10个潜在的功能性候选lncRNA,并通过体外集落培养功能实验(Colony forming units in culture,CFU-C)发现6个可能在胚胎造血发育中发挥作用的lncRNA,这6个lncRNA分别是H19,AI66270,4933439C10Rik,Gm15135,Gm17275和1700113A16Rik。并进一步利用条件性基因敲除的研究策略及AGM直接移植实验,着重阐明了lncRNA-H19对于AGM区HSC发生至关重要,单细胞转录组测序发现lncRNA-H19缺失后重要造血转录因子Runx1和Spi1的表达显著下调,假时序分析也证明lncRNA-H19缺失后阻滞了内皮向造血转化这一阶段。全基因组甲基化高通量测序数据分析发现lncRNA-H19的缺失使得重要造血转录因子(包括Runx1及Spi1等)的启动子区域高甲基化,内皮细胞特异性表达转录因子如Sox17的启动子区域低甲基化,提示lncRNA-H19可能通过调控重要造血转录因子和内皮细胞特异性转录因子的甲基化水平来下调表达或上调表达,以致血管内皮细胞向pre-HSC的转化受到阻滞。因为lncRNA所在位置决定了它们本身的功能,机制研究发现胞浆定位的lncRNA-H19部分通过抑制甲基化调控分子S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)的活性来调控目的基因的甲基化水平。有趣的是,我们还发现lncRNA-H19这一作用是独立于以往报道的lncRNA-H19作为microRNA前体(pri-miR)可能加工产生的产物mir-675而是其本身作用产生的。之前文献报道mir-675分子通过调控Igf1r-Igf2信号通路来维持成体HSC的静息状态。综上所述,我们这一研究在国际上首次揭示了HSC发生过程中发挥重要功能的lncRNA,并系统阐述了lncRNA-H19在胚胎HSC发生与成体HSC稳态维持中完全不同的功能以及调控方式。这些认识将为全面理解lncRNA调控重要生物学过程的机制提供重要启示,而且HSC发育全程的单细胞lncRNA图谱也将为HSC发育和再生机制研究提供重要的数据库和参考。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

图 2 造血干细胞发育中全新的未注释 lncRNA 分析A 热图展示造血干细胞发生中阶段特异性的未注释 lncRNAB 之前报道的 BM HSC 特异性 lncHSC1 和 LncHSC2 在六个细胞群体中的C pre-HSC、FL HSC 和 BM HSC 三个群体中 lncRNA 与 Goodell 数据库比析D lncRNA 与之前两项报道的比较分析E PCR 和 Sanger 测序验证未注释的 lncRNAF 未注释 lncRNA 验证结果和表达情况近年一系列研究证实 lncRNA 可通过调节邻近蛋白编码基因的转录，精密

图 3 从单细胞水平分析 lncRNA 与蛋白编码基因的相关性A lncRNA 在基因间和基因内的分布B lncRNA 与邻近基因成对 Pearson 相关性分析C 反式作用中 lncRNA 与邻近基因的相关性分析D 顺式作用中 lncRNA 与邻近基因的相关性分析E 根据与邻近基因的基因位置关系顺式中 lncRNA 的分类F 在所用细胞样品中六种 lncRNA 分布G 六种 lncRNA-mRNA 对的相关性分析H 代表性 lncRNA-mRNA 正负相关表达I 不同物种间 lncRNA 保守性分析造血干细胞发育中 LncRNA 的阶段性表达特征为了探索 HSC 发育过程中 lncRNA 的表达特征，我们首先在测序数据中挖9 个差异表达基因（图 4 A），接着主成分分析显示 128 个单细胞分成了独个不同的细胞群体，并能明显区分两个相似相近的发育阶段的细胞群体（

图 4 HSC 发育中差异表达 lncRNA 基因和特征性 lncRNA 基因A 差异表达 lncRNA 基因的热图展示B lncRNAs 主成分分析C T1、T2 pre-HSC 和 E12 HSC、E14 HSC 四个细胞群体中差异表达lncRNAsD 基于 lncRNA 表达的 qPCR 结果的主成分分析.3 通过蛋白编码基因的位置和表达相关性分析预测 LncRNA 功能由于在复杂的生理环境下生理过程中信号通路的激活或者相互作用而引起发生不同程度的表达，这样细胞中的基因会形成独特的基因表达模式，从而这个细胞群体或者生理过程的特征基因，这些特征基因被称为名片基signature gene），名片基因可以揭示不同细胞群体的特征及功能，还具有预测。近年来成体骨髓中 HSC 的蛋白编码基因方面的名片基因已被充分挖掘re-HSC 的蛋白编码基因的名片基因也通过比较真正 pre-HSC 群体和阴性群体行分析研究。为了进一步获得与 HSC 潜能相关的特征性 lncRNA 基因，我们将造血干细

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本文编号：2824062