MPTP帕金森小鼠模型中的肠道病理和肠道菌群研究

发布时间：2020-09-22 12:35

　　目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者通常具有与胃肠道(Gastrointestinal,GI)功能障碍相关的非运动症状,如便秘和胃排空延迟等,并且PD患者的非运动症状在运动症状发作前多年出现。至今,关于PD确切的发病机制尚不完全清楚,遗传因素、环境因素、氧化应激等均可能参与PD的进展。有研究结果显示,肠道菌群的变化可能与PD的发病机制有关,然而尚不完全清楚GI功能障碍和肠道菌群失调在PD中是如何发生的。鉴于GI功能障碍和肠道菌群在PD中的重要作用,我们研究了由慢性低剂量MPTP诱导的PD神经毒素模型是否能够再现PD的肠道病理特征,以及肠道菌群失调是否伴随该病理特征出现。方法:40只10周龄C57BL/6雄性小鼠经腹腔注射18mg/kg MPTP,每周两次,持续5周。通过测量1小时排便频率和粪便含水量来评估小鼠GI功能;通过爬杆实验评估小鼠的运动功能;通过蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测了小鼠黑质(Substantia nigra,SN)和回肠中酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)和Alpha-突触核蛋白(Alpha-synuclein,α-syn)的表达水平;通过液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测了小鼠纹状体和回肠中多巴胺(Dopamine,DA)含量;通过IF、酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测了小鼠SN的炎症表达;通过免疫组化(Immunofluorescence,IHC)、ELISA检测了小鼠回肠的炎症表达;通过ELISA测定血清中二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)的水平来评估小鼠肠屏障受损情况;此外,还通过高通量测序检测小鼠肠道菌群的组成情况。结果:我们发现MPTP在引起小鼠运动功能障碍之前就已引起GI功能障碍;PD小鼠SN和回肠的TH和α-syn表达减少;PD小鼠纹状体和回肠中的DA含量降低;MPTP引起小鼠SN和回肠中的炎症表达;PD小鼠的DAO和D-LA表达增加,表明其肠屏障已受损;高通量测序结果显示PD小鼠的肠道菌群组成发生了变化,特别是毛螺菌科、丹毒丝菌科、普雷沃氏菌科、梭菌目、丹毒丝菌目和变形菌门的丰度变化非常显著。结论:研究结果表明,慢性低剂量MPTP模型可用于评估PD早期阶段的肠道病理和肠道微生物失调的具体进展,这可能为PD的发病机制提供新的见解,并为从改善胃肠道健康的方面治疗PD提供新的思路。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R742.5;R-332
【部分图文】：

功能障碍,小鼠,纹状体

图 2 MPTP 诱导小鼠的 GI 功能障碍（mean ±SD, n=5）A：1 小时排便频率； B：粪便含水量Fig. 2 MPTP induces GI dysfunction.A: 1-hour fecal pellets; B: percent fecal water content over the course of the study.Note：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.0013.2 MPTP 降低小鼠纹状体和回肠中的 DA 含量DA 的浓度表明 DA 能神经元合成和释放 DA 的能力，它同时可以反映 DA 能神经元的受损程度。纹状体 DA 结果显示，在末次给药后的 2 天和 3 周这两个时间点，实验组小鼠的纹状体 DA 水平与各自对照组小鼠相比显著降低了 41.5 %和 13.3 %，并且实验组小鼠的DA在末次给药后3周的含量明显高于末次给药后2天的含量（图3A）。

纹状体,小鼠

图 3 MPTP 降低小鼠纹状体（A）和回肠（B）中的 DA 含量（mean ±SD, n=3）Fig. 3 MPTP reduces the DA content in the striatum （A） and ileum （B）.Note：***P < 0.001.3.3 MPTP 影响小鼠 SN 中的 TH 和 α-syn 表达TH 是 DA 合成的限速酶。为了研究 MPTP 对 DA 能神经元和 TH 表达在 SN中的影响，利用 WB 和 IF 实验来展现 TH 表达的具体情况。SN 的 WB 结果显示，与相应对照组比较，实验组小鼠在末次给药后 2 天和 3 周两个时间点的 TH 表达都显著降低；另外，实验组在末次给药后 3 周的 TH 表达低于末次给药后 2 天的表达（图 4A）。 IF 结果显示，与相应的对照组小鼠比较，MPTP 末次给药后 2 天和 3周小鼠的 TH 免疫反应性均显著降低，并且随着时间的推移，降低的趋势更加明显

比例尺,黑质,实验小鼠,趋势比

图 4 MPTP 影响 SN 中 TH 和 α-syn 的表达A：黑质的 TH 和 α-syn 在 WB 中的表达； B：SN 中 TH 在 IF 中的表达，比例尺是 200 μmC：SN 中 α-syn 在 IF 中的表达，比例尺是 50 μmFig. 4 MPTP influences TH and α-syn expression in the SN.A: Representative WB of nigral TH and α-syn expression; B: Representative IF staining foTH in the SN. Scale bar is 200 μm; C: Representative IF staining for α-syn in the SN. Scale bis 50 μm.3.4 MPTP 影响小鼠回肠中的 TH 和 α-syn 表达同样地，我们检测了回肠中 TH 和 α-syn 的表达情况。WB 结果显示，实验小鼠在末次给药后 2 天和 3 周两个时间点的 TH 表达与相应的对照组相比，都有定的增加，并且在末次给药后 2 天的增加趋势比后 3 周更明显（图 5A）。IF 结

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