H5N1和H1N1亚型流感病毒致病差异机制探索研究

发布时间：2020-09-22 15:15

　　甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是人群当中季节性流感流行和偶发的大流行的主要病原体,拥有广泛的宿主范围和变异程度,能够感染种类繁多的鸟类和哺乳动物,给人类社会带来严重危害。甲型流感病毒(IAV)是正黏科病毒(Orthomyxoviridae),基因组由八条单义负链RNA组成,编码包括核蛋白(Nucleoprotein,NP)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、血凝素(Hemagglutinin,HA)在内的十多种蛋白。根据其表面糖蛋白HA和NA的抗原特异性,甲型流感病毒可以进一步分成多种亚型。甲型流感病毒的不同亚型在感染人体后引起不同的致病表现型。当病毒入侵宿主后,病毒蛋白会和宿主蛋白相互作用操纵宿主信号通路以利于自身复制和生存。在宿主众多的信号通路中,NF-κB信号通路是比较重要的抗病毒信号通路。当病原微生物入侵人体时,病原微生物的毒力蛋白或者遗传物质充当配体与细胞表面的受体相结合,通过一系列的接头蛋白将信号传递给IKK复合物,被活化的IKK复合物会激活IκB,使IκB泛素化降解,然后与核因子κB解离。核因子进入细胞核,结合相关基因,促进基因转录,使宿主细胞表达出抗病毒的细胞因子,以此实现抗病毒的效果。NF-κB信号通路存在于几乎所有的动物细胞中,是信号通路研究领域的热点问题。病毒蛋白和宿主蛋白之间的直接相互作用为流感病毒入侵宿主引起复杂的病理状况提供了基础。甲型流感病毒的不同亚型在感染人体后引起不同的致病表现型是因为不同亚型的流感病毒与宿主信号通路的关系不同,即不同流感病毒的不同蛋白和人体信号通路相互作用产生不同的生理效应。我们设计实验来探索流感病毒蛋白和NF-κB信号通路关系以及相互作用位点的差异来验证我们的猜想。在我们的实验中,我们选取了H5N1和H1N1亚型流感病毒的两组蛋白神经氨酸酶NA和核蛋白NP,通过双荧光素酶报告基因实验确定病毒蛋白和NF-κB信号通路的关系以及病毒蛋白影响NF-κB信号通路的可能位点,随后我们利用免疫共沉淀实验确定病毒蛋白影响NF-κB信号通路的具体位点。具体实验结果如下:1、H5N1和H1N1亚型流感病毒的NP蛋白和NF-κB信号通路的关系存在差异H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路,作用位点在TAK1与IKKα处。H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制TN F-α介导的NF-κB-1uc转录活性;免疫印迹实验结果显示H5N1亚型流感病毒的NP蛋白增加IκBα的蛋白表达水平,抑制IκBα的磷酸化;免疫荧光实验显示H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制p65蛋白入核,以上结果说明H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路。H5N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制TAK复合物和IKKα蛋白介导的NF-κB-1uc转录活性,与TAK1以及IKKα 具有相互作用且抑制IKKα的磷酸化,说明H15N1亚型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信号通路的作用位点在TAK1与IKKα处。H1N1亚型流感病毒的NP蛋白对NF-κB信号通路没有影响。H1N1亚型流感病毒的NP蛋白不影响TNF-α介导的NF-κB-Iuc转录活性,对IκBα的蛋白表达水平和IκBα的磷酸化以及p65蛋白的核转位没有影响说明H1N1亚型流感病毒的NP蛋白对NF-κB信号通路没有影响。2、H5N1和H1N1亚型流感病毒的NA蛋白和NF-κB信号通路的关系也存在差异H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB 号通路,作用位点在TAB2处。H5N1亚型流感病毒的NA蛋白上调IL-1β介导的NF-κB-1uc转录活性,说明H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信号通路。H5N1亚型流感病毒的NA蛋白增强TAK复合物介导的NF-κB-Iuc转录活性,与TAB2蛋白具有直接相互作用,说明H5N1亚型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信号通路的作用位点在TAB2处。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路,作用位点在IKKβ处。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制IL-1β介导的NF-κB-Iuc转录活性说明H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路。H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制TAB2和IKKβ介导的NF-κB-Iuc转录活性,与IKKβ具有直接相互作用,说明H1N1亚型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信号通路的作用位点在IKKβ处。结果一和结果二的对比,验证了我们的猜想不同流感病毒的不同蛋白和人体信号通路相互作用产生不同的生理效应,即流感病毒和宿主蛋白相互作用具有亚型特异性特征,其可响应不同亚型的流感病毒的特定致病机制。对实验结果的分析也表明流感病毒的不同亚型可以影响NF-κB信号通路是否抗病毒以及抗病毒的能力。
【学位单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373.13
【部分图文】：

流感病毒,生命周期,甲型流感病毒

（ｓｅｇｍｅｎｔ）构成，其中甲型和乙型流感病毒基因组都含有八个ＲＮＡ节段，而丙型逡逑和丁型流感病毒仅含有七个节段［９］。本文的研宄对象为甲型流感病毒的重要亚逡逑型，以下流感病毒如未特别指明即为甲型流感病毒。甲型流感病毒结构如图１逡逑所示，八个ＲＮＡ节段构成的基因组编码转录１０种病毒必需蛋白质和几种菌株逡逑村丨关（ｓｔｒａｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）的辅助蛋白｜｜（）），共计可达丨８种。ＲＮＡ节段１编码病毒聚逡逑介酶碱性蛋白邋２（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋Ｂａｓｉｃ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋２，邋ＰＢ２）和邋ＰＢ２－Ｓ１，邋ＰＢ２邋通过与宿主逡逑ｍＲＮＡｃａｐｓ结合，在病毒ｍＲＮＡ转录起始阶段发挥着重要作用，ＰＢ２－Ｓ１通过逡逑病毒转录后选择性剪接得到的ｍＲＮＡ翻译产生，能够抑制ＲＩＧ－Ｉ依赖的信号通逡逑路丨１１】。ＲＮＡ节段２编码聚合酶碱性蛋白ｌ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋Ｂａｓｉｃ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，ＰＢ１），ＰＢ１逡逑作为ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶，在ＲＮＡ聚合酶复合物中起着促进新生病毒ｍＲＮＡ逡逑延伸的作用

科学界,蛋白结构,家族,核因子

图１．３邋ＮＦ－ｋＢ家族蛋白结构（引自［４６］）逡逑（２）邋ＩｋＢ当科学界最初发现ＮＦ－ｋＢ时，认为它仅存在于Ｂ细胞中，后续逡逑研宄发现在别的细胞中也能检测到ＮＦ－ｋＢ，科学家最初以为ＮＦ－ｋＢ是持续性激逡逑活的，然而在之后的研究中发现，细胞中存在一种物质能够抑制ＮＦ－ｋＢ的活性，逡逑这一物质就是核因子ｋＢ抑制剂（ＩｋＢ），它会在ＮＦ－ｋＢ激活的时候失活ｔ４７］。目前逡逑研宄发现邋ＩｋＢ邋家族有邋ＩｉｃＢａ、ＩｉｃＢｐ、ＩｋＢｓ、ＩｋＢＤＬ、ＩｋＢＲ、ｐｌ０５、ｐｌＯＯ、ＩｉｃＢｙ邋八逡逑个成员，其中ＩＫＢａ分子量为３７１ｃＤａ，它的活性会被ＩｋＢ激酶复合物的不同亚基逡逑抑制，ＩｋＢＰ分子量为４３ｋＤａ，当使用磷酸化处理时，ＩｋＢＰ与核因子ｋＢ结合的逡逑活性会被抑制，ＩｋＢｓ控制Ｒｅｌ／ＮＦ－ＫＢ转录复合物子集的活性，ＩｋＢＤＬ和ＩｋＢＲ与逡逑ＮＦ－ｋＢ活性调节的相关性仍然不确定，ｐｌ０５和ｐｌＯＯ是核因子ｋＢ的前体物质，逡逑以失活状态存在于细胞质中［４８］。逡逑ＩｋＢ家族中的所有亚基都存在锚蛋白重复序列，在蛋白质和蛋白质相互作用逡逑中具有重要作用。丨ｋＢ和ＮＦ－ｋＢ的相互作用的过程中也会用到锚蛋白重复序列。逡逑

蛋白结构,家族

Ｐｎｆ＾ｂ５ｉ°逦＝＃｜ＥＺ＾ＩＩＭ＝＾＾：＝３ＱＱＱＱａ＝ＱＱ：＾￣－—逡逑图１．３邋ＮＦ－ｋＢ家族蛋白结构（引自［４６］）逡逑（２）邋ＩｋＢ当科学界最初发现ＮＦ－ｋＢ时，认为它仅存在于Ｂ细胞中，后续逡逑研宄发现在别的细胞中也能检测到ＮＦ－ｋＢ，科学家最初以为ＮＦ－ｋＢ是持续性激逡逑活的，然而在之后的研究中发现，细胞中存在一种物质能够抑制ＮＦ－ｋＢ的活性，逡逑这一物质就是核因子ｋＢ抑制剂（ＩｋＢ），它会在ＮＦ－ｋＢ激活的时候失活ｔ４７］。目前逡逑研宄发现邋ＩｋＢ邋家族有邋ＩｉｃＢａ、ＩｉｃＢｐ、ＩｋＢｓ、ＩｋＢＤＬ、ＩｋＢＲ、ｐｌ０５、ｐｌＯＯ、ＩｉｃＢｙ邋八逡逑个成员，其中ＩＫＢａ分子量为３７１ｃＤａ，它的活性会被ＩｋＢ激酶复合物的不同亚基逡逑抑制，ＩｋＢＰ分子量为４３ｋＤａ，当使用磷酸化处理时，ＩｋＢＰ与核因子ｋＢ结合的逡逑活性会被抑制，ＩｋＢｓ控制Ｒｅｌ／ＮＦ－ＫＢ转录复合物子集的活性，ＩｋＢＤＬ和ＩｋＢＲ与逡逑ＮＦ－ｋＢ活性调节的相关性仍然不确定

【相似文献】