G-CSF诱导THP-1分化巨噬样细胞的可塑性分析

发布时间：2020-09-24 10:01

　　集落刺激因子(colony-stimulating factors,CSFs)是分泌糖蛋白,以结合造血干细胞表面上的受体,从而激活细胞内信号传导途径并使细胞增殖、分化成特定种类的细胞因子。CSFs包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,macrophage-CSF),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,granulocyte-macrophage-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF,granulocyte-CSF)。GM-CSF通常用于将单核细胞分化为Ⅰ型巨噬细胞(type 1 macrophage,M1),M-CSF用于将单核细胞分化为Ⅱ型巨噬细胞(type 2 macrophage,M2)。G-CSF通常用于临床促进骨髓干细胞向外周血的动员以辅助治疗中性粒细胞减少症。然而,它在单核细胞分化中的作用很少被研究。因此,本研究的主要目的是明确G-CSF能否分化单核细胞成为MΦ的表型以及由GCSF分化单核细胞的MΦ表型,在有或没有佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)预处理,然后通过LPS向M1或M2亚型极化。虽然用不同的分化处理对原代单核细胞和单核细胞系分化形成MΦ极化趋向M1和M2,但不一定具有典型的M1或M2免疫生物学表型,具有可塑性。1、G-CSF稳定表达细胞的建立。构建慢病毒表达系统,通过转染和转化成功建立稳定表达M-CSF、GM-CSF、G-CSF的293T细胞系,应用蛋白免疫印迹、免疫荧光以及ELISA测定了细胞的MCSF、GM-CSF、G-CSF稳定表达水平,证实获得M-CSF、GM-CSF、G-CSF稳定表达的293T细胞系。2、流式鉴定M/GM/G-CSF分化THP-1与巨噬样细胞。通过细胞流式分析M1标志物CD80、CD86、MHCⅡ和M2标志物CD16,检测不同CSF诱导分化单核细胞的细胞表面标志蛋白表达。结果显示,G-CSF将THP-1细胞分化为M2,如M-CSF,而不像GM-CSF将THP-1细胞分化成M1。PMA将THP-1分化为M1,然后G-CSF、GM-CSF和M-CSF的分化对PMA刺激的MΦ亚型没有显著影响。通过PMA刺激THP-1得到MΦ样细胞被3个CSFs分化,再通过LPS极化后,巨噬样细胞更加向M1极化,使CD80或CD86表达更多,CD163表达更少。3、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分析不同CSF分化THP-1获得巨噬样细胞的细胞因子表达。利用qRT-PCR对IL-6,IL-8,IL-12,IL-23(炎性免疫应答产物)和IL-10 mRNA(抑炎性免疫应答产物)表达进行分析。结果显示,用LPS刺激后,使用PMA、G-CSF、GM-CSF和M-CSF从THP-1分化的MΦ-like均具有良好的炎性标志物表达水平,抑炎免疫应答产物IL-10没有显著表达。4、巨噬样细胞对结核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,Mtb)H37Ra吞噬及杀伤的影响用Mtb H37Ra感染MΦ,以研究感染后第一时间的免疫应答特性。研究表明,PMA组中经三种集落刺激因子诱导的巨噬样细胞都被Mtb H37Ra进一步活化,炎性因子IL-8均显著表达。在对CSFs分化的巨噬样细胞感染Mtb H37Ra的吞噬及杀菌能力分析后,显示被G-CSF分化的巨噬样细胞吞噬能力仅次于GM-CSF分化的巨噬样细胞,却又强于M-CSF。G-CSF分化的巨噬样细胞在72h的杀菌能力与MCSF无差异,但杀菌能力却显著弱于GM-CSF分化的巨噬样细胞。总之,由PMA驱动的G-CSF分化的MΦ样细胞在其表面标记和细胞因子表达方面与GM-CSF分化的MΦ样细胞相似。在细胞表面标志物表达方面,来自THP-1的G-CSF分化的MΦ是M2,类似于M-CSF分化的巨噬细胞,但是在细胞因子表达方面G-CSF分化THP-1具有低水平的IL-10表达。在PMA驱动下G-CSF分化的巨噬样细胞的噬菌能力增加,但杀菌能力并不像GM-CSF。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

单核细胞,方案,巨噬细胞

第一章文献综述系统的影响。观察到服用 G-CSF 的健康志愿者的血液显示出促炎细胞因子（如TNF- （肿瘤坏死因子）、GM-CSF）在体外用脂多糖（LPS）刺激时的释放能力减弱，表明 G-CSF对炎症免疫反应有抑制作用[39]。为阐明 M1和 M2 各自的功能，现将人源的单核细胞和巨噬细胞定向分化成 M1或 M2 巨噬细胞的方案已日趋成熟，最常规的方案便是利用 GM-CSF/LPS±IFN-γ 组合诱导单核细胞分化成促炎的 M1 巨噬细胞；利用 M-CSF±IL-4 组合将单核细胞分化成抑炎型的 M2巨噬细胞[40,41]，如图 1。

稳定表达,实验验证,稳定转染,标签

13图 2 M/GM/G-CSF稳定表达的实验验证。Figure 2. Experimental validation of stable expression of M/GM/G-CSF.A. 稳定转染 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF 的细胞标签荧光图。 B. Weston blot 对 M-CSF、GMCSF 和 G-CSF 表达量的鉴定。 C. ELISA 在蛋白水平测定 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF 的表达量

细胞,浓度,贴壁细胞,流式数据

弃液后加入配置好且预冷含胰蛋白酶的 FACS washing buffer 400 μl，在冰盒上摇至贴壁细胞脱落（对于难以脱落的细胞孔使用移液枪吹吸），悬浮于 400 μl 冷 FACS溶液中，将贴壁细胞处理并收集于实验组流式管内，并与 PE-Cy7-Hu CD80、PE-HuCD86、FITC-Hu MHCⅡ或 APC-Hu CD163 的抗体反应，4℃孵育 30 min，PBS 洗 3次，用 100 μl PBS 重悬，上流式细胞仪检测。设置同型对照组，每管均加入同型抗体：CD80-Ms IgG1、CD86-Ms IgG2b Kpa、CD163-Ms IgG1 Kpa ITCI、MHCⅡ-MsIgG2a Kpa ITCI。通过在正向和侧向散射上设置门，显示活细胞的光散射特性的细胞，从分析中排除细胞碎片。对每个样品分析最少 104个细胞。3.2.4 统计学分析使用 FlowJo v10 软件进行流式数据分析。3.3 实验结果3.3.1 不同浓度 PMA 刺激下，THP-1 分化后的细胞形态

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