P物质与NK细胞通过神经免疫调节在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎发病机制中的作用研究

发布时间：2020-09-29 12:03

　　第一部分先天性巨结肠模型小鼠(Ednrb敲除小鼠)肠道P物质及NK细胞的变化在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎发病中的作用目的:使用Ednrb敲除小鼠作为先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HD)模型小鼠,研究在未发生及发生先天性巨结肠相关性小肠结肠炎(Hirschsprung disease associated enterocolitis,HAEC)时肠管扩张段及狭窄段P物质(Substance P,SP)及NK细胞的变化,并探究SP及NK细胞相互作用在HAEC发病中的机制。方法:从美国Jackson实验室购买Ednrb敲除小鼠,分为HD组和野生型对照组,并按小鼠年龄分为1周(week,w)、2w及3w组,3w组HD小鼠发生HAEC。HE染色对肠管炎症程度进行评估,转录组测序分析各组肠管的基因表达差异,免疫组化和荧光染色分析扩张段及狭窄段肠管SP及NK细胞表达情况,RT-q PCR和Western blot分别在m RNA和蛋白水平分析SP和NK细胞相互作用过程相关的SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma、穿孔素、颗粒酶B及IL22的表达,代谢组学研究结肠内粪便的代谢化合物变化并关联分析与肠组织基因表达之间的关系。结果:3w组HD小鼠发生HAEC,且扩张段炎症表现严重,狭窄段轻微;转录组测序发现3w HD小鼠扩张段的基因表达变化最为明显,主要为免疫系统、内分泌系统、神经系统及消化系统相关基因,狭窄段基因表达变化并不如此明显,但SP在3w HD小鼠的狭窄段中明显上升。免疫组化和荧光染色显示3w小鼠狭窄段SP表达升高,NK细胞及其亚群NK-22细胞增加,SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma及IL22的表达在3w HD小鼠狭窄段上升。代谢组学研究发现淀粉及蔗糖代谢途径和戊糖及葡糖糖醛酸转化途径在发生HAEC小鼠中出现明显改变并与多种神经相关基因明显相关。结论:HD小鼠发生HAEC时,扩张段炎症严重而狭窄段较轻,而狭窄段是肠神经系统异常的部位,狭窄段的SP、NK细胞、SP在免疫细胞上的受体NK1R、及NK细胞分泌相关因子表达增加,说明SP与NK细胞之间的神经免疫调节可能在HAEC发生时起到维持肠道稳态的作用。第二部分HD患儿肠道SP及NK细胞的变化在HAEC发病中的作用目的:收集HD患儿肠道标本,对人类HD肠管扩张段和狭窄段SP的表达及NK细胞的分布情况进行研究,探究SP与NK细胞在HAEC发病中的作用。方法:收集HD患儿的肠道标本,按照有无HAEC进行分组,并取无肠神经节发育异常的先天性肛管直肠畸形患儿的肠管作对照组,行HE染色评估肠道炎症,通过免疫组化及荧光的方法观察SP及NK细胞在各段肠管的表达情况,利用RT-q PCR及Western blot从m RNA及蛋白水平分析SP及NK细胞相互作用过程中的SP、CD16、NK1R、IFNgamma、穿孔素、颗粒酶B及IL22表达情况。结果:在发生HAEC的患儿肠道狭窄段炎症表现弱于扩张段,免疫组化及荧光染色发现其狭窄段表达较多的SP及分布更多的NK细胞,在未发生HAEC的HD患儿组的结果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma、颗粒酶B、穿孔素及IL22在对照组、实验组扩张段及狭窄段中的m RNA及蛋白表达水平相似,均未见明显差异。在发生HAEC患儿组的结果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma及IL22的m RNA及蛋白表达水平在HAEC组狭窄段的表达水平高于扩张段及对照组;颗粒酶B的m RNA及蛋白表达水平在扩张段的表达高于狭窄段,但与对照组未见明显差异;穿孔素的m RNA及蛋白表达水平在扩张段的表达水平高于狭窄段和对照组。结论:HD患儿发生肠炎时,扩张段炎症重于狭窄段,狭窄段的SP、NK细胞及相关因子表达增加,说明SP与NK细胞之间的神经免疫调节可能在患儿发生HAEC发生时起到维持肠道稳态的作用。第三部分体外实验研究SP与NK细胞的相互作用及机制目的:分选小鼠结肠的NK细胞和培养人NK细胞系NK92MI细胞,分别加SP刺激培养后,观察NK细胞的功能变化并对其中机制进行探讨。方法:磁珠分选纯化小鼠结肠NK细胞。分为对照组、梯度浓度SP刺激组及NK1R拮抗剂Aprepitant+梯度浓度SP刺激组,LDH释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA检测培养上清中IFNgamma的浓度,免疫荧光观察NK细胞IFNgamma及IL22表达。NK92MI细胞系按同样条件分组,并检测NK92MI细胞杀伤活性及培养上清中IFNgamma的浓度,将SP刺激后的NK细胞进行转录组测序分析其中可能作用机制,利用Caco2细胞构建肠上皮屏障模型,免疫荧光及Western blot观察SP刺激后的NK细胞对紧密连接蛋白ZO-1的影响。结果:本实验所采用方法提取NK细胞的纯度为93.50%。SP可增强小鼠Nkp46(+)NK细胞的杀伤活性并促进其分泌IFNgamma和IL-22的作用,且与浓度相关,最佳浓度为10-8M,Aprepitant可阻断此作用;SP可增强NK92MI细胞系的杀伤活性及促进其分泌IFNgamma,最佳浓度为10-10M,转录组测序显示MAPK信号其中作用。加入SP处理的NK92MI细胞组中Caco2细胞的ZO-1表达水平下降最明显。结论:SP可增强NK细胞的活性并促进其分泌作用,通过受体NK1R起作用,相关通路可能为MAPK信号通路,仅具有杀伤功能的NK92MI细胞系对肠上皮具有破坏作用,而提取的Nkp46(+)小鼠原代NK细胞,由于包括NK-22细胞群,其分泌的IL22对肠上皮具有修复和保护作用,二者的相互平衡使肠道对病原具有更强杀伤抑制作用同时可保护肠上皮完整性维护肠道稳态。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R726.5;R-332
【部分图文】：

模型小鼠,基因型鉴定,基因型,巨结肠

巨结肠模型小鼠基因型鉴定出现 244bp 和 44仅在 444bp 出现一条条带的基因型为 Ednrb+/+下图左侧所示，与 Ednrb+/-表型相同，Ednrb-/

先天性巨结肠,粘膜层,小鼠,近端

图 1-2 1w、2w 及 3w 小鼠结肠标本 HE 染色情况 1w 和 2w 先天性巨结肠小鼠与对照组相比实验组结肠近端和远端无明显炎症表现，粘膜结构完整，无炎症细胞浸润，3w 先天性巨结肠小鼠在扩张段（近端）结肠的粘膜层，出现了隐窝脓肿，且在粘膜层和粘膜下层可见较多中性粒细胞浸润，狭窄段（远端）结肠未见明显炎症表现。（HD，先天性巨结肠）

分布情况,基因表达,整体描述,样本

标本的基因表达水平显示了样本基因表达的分布情况及样品中基因丰度随表达量变化的趋势，对所测样本的基因表达量进行了整体描述

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