恶性疟原虫入侵关键蛋白质P18和P187的发现及功能研究

发布时间：2020-09-30 01:39

　　 疟疾是由疟原虫引起的严重危害人类健康的寄生虫病之一。据世界卫生组织统计,2017年全球范围内共有2.19亿疟疾病例,有44.5万人死于疟疾,且在2015年到2017年间疟疾病例数轻微上升,疟疾的全球防控仍然面临着巨大挑战。药浸蚊帐、快速诊断试剂盒、以青蒿素为基础的复方药物等防治措施效果显著,但按蚊对杀虫剂出现抗性的现象加剧、青蒿素抗性虫株的出现以及疟疾疫苗的缺失使全球范围内疟疾的防控形势更加严峻。在五种可以感染人类的疟原虫中,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)流行范围广泛,致病力最强,危害最严重。恶性疟原虫的生活史具有宿主交替与世代交替的特点,该虫体经按蚊传播,在人的肝脏和红细胞内进行无性生殖,在按蚊体内进行配子生殖和孢子生殖。虫体在红细胞内寄生时期是疟原虫生存及致病的关键阶段,而裂殖子入侵宿主红细胞是其中的关键环节。更好地理解该时期虫体与人体细胞的相互作用和分子机制对于揭示疟原虫致病机理及疫苗靶点等方面都是非常重要的。现有的疟疾疫苗在小动物研究中多具有良好的保护效果,有的已经完成三期临床研究,但是有效率低、保护时间短、效果欠佳,目前原因尚不清楚。本课题组的前期研究发现,宿主针对高免疫原性裂殖子抗原产生的抗体不仅不具有保护性作用,反而能够掩护关键的疟原虫功能性靶点,甚至直接协助虫体入侵红细胞。而传统的疟疾疫苗候选抗原的筛选多基于血清学筛查高免疫原性抗原。因此开阔视角,开发新的疟原虫抗原,特别是功能性抗原,可能是打破疟原虫免疫耐受,制备切实有效的疟疾疫苗的关键。发掘关键的疟原虫功能蛋白,需要对疟原虫基因表达规律进行深入解析。恶性疟原虫3D7株核基因组由分布在14条染色体上的22.8兆碱基组成,共有大约5300个编码蛋白质的基因。据预测,这些基因编码的蛋白质有60%是疟原虫独有的。由于传统基因研究方法在恶性疟原虫研究中耗时长、效率低、技术要求高,因此许多高通量方法用于研究基因功能信息。其中,基因表达谱分析已经成为研究基因功能的重要手段。但是,现有的疟原虫转录组数据多基于早期的基因组测序信息,数据不完整,很多基因没有被包括在内,无法精准展现疟原虫在不同生长发育时期的基因转录规律,因此后期的研究无法直接采纳相关数据。本课题承担中国医学科学院医学与健康科技创新工程《重要寄生虫病基础与防治技术研究》部分研究任务,采集高度同步化的虫体,采用实时荧光定量PCR对恶性疟原虫红内期6个关键生长发育时间节点的虫体进行染色体基因精准转录分析,建立精准而全面的恶性疟原虫转录组数据库,利用该数据库的转录组信息,分析疟原虫生长发育过程中基因的表达规律,发掘入侵时期高表达的基因,继而对恶性疟原虫入侵宿主红细胞相关蛋白质进行筛选及功能研究。本课题收集入侵红细胞后Oh、8h、16h、24h、32h和40h等6个时间点发育高度同步化的红内期虫体,使用实时荧光定量PCR法对恶性疟原虫三号染色体243个编码蛋白质的基因和四号染色体246个编码蛋白质的基因进行转录水平分析。之后经过表达差异基因聚类分析,共发现63个基因在裂殖子期特异性高表达。经过文献检索及生物信息学分析,在三号染色体裂殖子期特异性高表达的基因中,4个基因为未知功能的基因,采用原核表达纯化技术制备了这四个蛋白的重组蛋白质。在红细胞结合实验中,发现两个重组蛋白质P18和P187具有与红细胞结合的能力,继而进行了深入研究。用免疫印迹实验证实相应蛋白质的确在裂殖子期高表达,免疫荧光实验获得其在虫体内的细胞定位。在后续功能实验中,发现这两个重组蛋白质的红细胞结合作用均不受胰蛋白酶、乳糜蛋白酶、神经氨酸酶的影响,表明这种结合与红细胞表面的唾液酸残基及血型糖蛋白A、B和C部分胞外区无关。转染表达目的蛋白质的中国仓鼠卵巢细胞与红细胞结合出现花环现象。肝素结合实验及结合抑制实验表明,重组蛋白质可能与广泛分布于红细胞表面的肝素样分子结合。这些结果提示这两个蛋白质可能在虫体入侵红细胞过程中发挥作用。体外入侵抑制实验表明,两个蛋白质的多克隆抗体血清能够影响虫体的增殖。酶联免疫吸附实验进一步揭示了蛋白质P18和P187的抗原性,进一步判断其可能的细胞功能及潜在的抗疟感染价值。综上所述,本课题利用实时荧光定量PCR法对恶性疟原虫第三、四号染色体编码蛋白质的基因进行全面精准的转录组学分析,确定了相关基因在虫体红内期表达的规律,为深入研究疟原虫红内期生长发育及致病机理奠定了基础。通过筛选裂殖子入侵红细胞时特异性高表达的基因编码的蛋白质进行后续功能研究,为发现新的入侵相关虫体抗原及潜在的疫苗候选抗原提供有价值的线索。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R382.31
【部分图文】：

世卫组织非洲区域仍然是疟疾流行最严重的地区，疟疾病例约为２亿例，占全球病逡逑例总数的９２％，其次分别是世卫组织东南亚区域（５％）和东地中海区域（２％）（见逡逑图１）邋［４］。恶性疟原虫是世卫组织非洲区域最流行的疟疾寄生虫，占２０１７年非洲区逡逑域估计疟疾病例总数的９９．７％［火在全球范围内，约３．４％病例由间日疟原虫引起，逡逑其中５６％间日疟病例发生于世卫组织东南亚区域［４］。世卫组织美洲区域的大部分疟逡逑疾病例（７４％）是由间日疟原虫引起，而在东南亚区域和东地中海区域这一比例分逡逑别是３７％和３１％［４］。大约８０％疟疾病例发生于非洲１５国和印度，其中，尼日利亚逡逑（２５％）、刚果民主共和国（１１％）、莫桑比克（５％）、印度（４％）和乌干达（４％）疟疾负担最逡逑为严重［４］。逡逑２０１０年至２０１７年，全球疟疾发病率从每千人７２例降至５９例，但在过去３年逡逑中变化速度放缓，每千人风险人群疟疾发病率停滞在５９例Ｉ４］。除了世卫组织东南亚逡逑地区，疟疾发病率一直变化平稳，而在美洲地区有所增加，主要原因是巴西、尼加逡逑拉瓜和委内瑞拉（玻利瓦尔共和国）发病率增加ｗ。２０１０年至２０１７年间，全球疟疾逡逑死亡病例数从６０．７万例下降到４３．５万例

为实现这一点，疟原虫经历了一系列不同的形态学阶段，在特定的发育逡逑阶段入侵不同的细胞［２３］，比如孢子体感染肝细胞、裂殖子入侵红细胞、动合子进入逡逑蚊中肠上皮细胞等，而每一阶段都有其各自的生物学特性（见图２）。逡逑１３逡逑

图１．３体外培养的恶性疟原虫在红内期各时间点的细胞形态逡逑

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1 李姗姗;恶性疟原虫入侵关键蛋白质P18和P187的发现及功能研究[D];北京协和医学院;2019年

本文编号：2830559