基于转录组学解析半胱氨酸抑制艰难梭菌（Clostridium difficile）产毒的研究

发布时间：2020-10-10 11:47

　　 艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种革兰氏阳性、严格厌氧的产芽孢杆菌,是抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎的主要致病菌。随着广谱抗菌药物的广泛使用及高毒力流行性菌株的出现,艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)相关疾病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,已成为威胁全球公共健康的重要流行性疾病之一。长期或过量服用抗生素会破坏肠道菌群微生态的平衡,艰难梭菌乘机快速繁殖,并产生大量的毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)。这两种毒素是CDI的主要致病因子,具有细胞毒性和肠毒性,能够导致肠道炎症反应,从而引发CDI相关疾病。研究表明,艰难梭菌毒素的合成与外部环境的变化密切相关,如培养基营养成分、培养温度、氧化还原电位变化等。目前人们对艰难梭菌毒素基因表达调控的分子机制依然了解甚微。本论文从分析氨基酸对艰难梭菌产毒水平的影响出发,采用高通量测序技术揭示半胱氨酸对艰难梭菌胞内全局代谢过程的影响,研究了半胱氨酸脱硫酶CdsB(cysteine desulfidase B)和碳存储调控因子CsrA(carbon storage regulator A)在艰难梭菌中的功能及其对致病相关代谢过程的调控作用,为今后对艰难梭菌氨基酸代谢调控研究提供了大量基础数据,对探究艰难梭菌毒素基因表达调控机制具有重要参考价值,还为CDI相关疾病有效治疗药物的开发提供了一定的理论依据。本论文主要内容及结论如下:本研究分析了TY培养基中不同氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸和精氨酸)的添加对艰难梭菌产毒水平的影响,发现添加半胱氨酸能够显著抑制艰难梭菌R20291菌株毒素基因表达水平。将艰难梭菌R20291菌株分别在TY培养基和添加5 mM半胱氨酸的TY培养基(即TYC培养基)中培养,经过4小时、8小时和12小时取样,运用RNA-Seq技术进行转录表达谱分析,分别发现了216、469和756个差异表达基因(差异倍数大于2且p-value值小于0.01)。在不同处理时间下,差异表达基因的集群显著不同,主要集中在氨基酸、硫和铁的转运、丁酸合成、Wood–Ljungdahl通路、电子传递产能以及鞭毛合成等方面。艰难梭菌对半胱氨酸的响应是一个复杂而又系统的过程,涉及细胞内的诸多代谢过程,结合已有报道,推测铁的转运、氨基酸代谢、能量代谢及鞭毛合成等过程可能对半胱氨酸依赖的产毒调控具有重要影响。利用ClosTron技术分别构建cdsB、eutW、eutVW、feoB1、feoB2和feoB3基因灭活(突变)菌株,并比较突变菌株与野生型菌株在TY和TYC培养基中的产毒水平。结果发现,eutVW、eutW、feoB1、feoB2和feoB3基因灭活对艰难梭菌产毒水平无显著影响,而cdsB基因的灭活解除了TYC培养基中半胱氨酸对艰难梭菌产毒水平的抑制作用。通过生物信息学和酶谱法对艰难梭菌CdsB的功能进行了鉴定,结果表明,CdsB是艰难梭菌胞内一种主要的诱导型半胱氨酸脱硫酶,添加半胱氨酸时,胞内cdsB基因的表达水平显著上调,硫化氢产量显著提高。通过5'RACE和启动子活性测定实验,发现cdsB基因启动子是δ~(54)依赖型启动子,其转录起始是在半胱氨酸诱导下,由δ~(54)和增强子蛋白CdsR共同参与完成。利用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹比较野生型菌株、cdsB突变菌株和cdsB回补菌株毒素基因表达水平,发现cdsB突变菌株在TYC培养基中培养时tcdA和tcdB表达水平显著高于野生型菌株,而cdsB回补菌株毒素基因的表达水平与野生型菌株相当,说明半胱氨酸对艰难梭菌产毒的抑制作用与胞内半胱氨酸的降解有关。进一步比较了半胱氨酸降解产物硫化钠、丙酮酸和氯化铵对艰难梭菌产毒水平的影响,结果发现硫化钠能显著抑制艰难梭菌的产毒水平。因此,半胱氨酸对艰难梭菌产毒的抑制作用可能是由于半胱氨酸降解产物的积累,特别是硫化氢的积累引起的。CsrA是一种全局转录后调控因子,能调节鞭毛合成、毒力因子表达和生物膜形成等多种毒力相关过程。在艰难梭菌中对CsrA的功能进行了分析鉴定,结果发现csrA基因的过表达能够导致艰难梭菌运动性减弱、鞭毛缺陷,对Caco-2细胞的粘附性显著增强,产毒水平显著上调,丁醇和乙醇的产量显著提高。通过序列分析,发现在鞭毛蛋白基因fliC上游非编码区含有CsrA保守结合位点,由此推测CsrA可能直接与fliC mRNA结合参与fliC的表达调控,而其对产毒水平的影响可能是由于fliC表达水平的变化引起的。因此,CsrA在艰难梭菌中参与了鞭毛合成、毒素基因表达、粘附和产溶剂等多个过程的调控。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R378
【部分图文】：

第一章 绪论cdE140表示；研究表明，与TcdE140相比，TcdE166和TcdE142的表达能够有效促进毒，且其表达水平对细胞存活率有重要影响，不同的翻译产物在TcdE介导的毒素中可能发挥着特定的作用[120]。然而，TcdE是如何介导毒素释放，以及这三种构体在释放过程中的作用还有待进一步研究。 外环境变化对艰难梭菌毒素基因表达的调控作用研究表明，艰难梭菌的产毒水平会受到外部环境条件变化的影响，如营养成分度等等，其中营养物质信号被认为是影响产毒水平最重要的环境因素之一。.1 葡萄糖

华南理工大学博士学位论文NA-Seq 流程如图 1-3 所示，主要包括实验设计、样品制备、文库构建、高物信息学分析五个环节[181]。首先结合研究目的和预算进行实验设计，确测序深度；然后提取样本总 RNA，进行 mRNA 分离纯化；将 mRNA 样本反转录，连接测序接头，富集，完成测序样本的文库构建；上机测序；测滤后，与参考基因组比对或者从头组装，对 reads 进行计数及表达水平统行差异表达基因分析、代谢通路分析、共表达网络分析和 GO 富集分析等

技术路线示意图
【参考文献】

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1 徐亚青;邓敏;;难辨梭状芽胞杆菌医院感染的流行病学特征及感染控制现状分析[J];中华医院感染学杂志;2013年20期

2 黄怡;聂玉强;;难辨梭状芽孢杆菌相关性腹泻与抗生素相关性腹泻的临床流行病学比较[J];广东医学院学报;2009年04期

本文编号：2835145