乙肝核心蛋白嵌合奈瑟菌表面蛋白A重组蛋白疫苗免疫效果研究

发布时间：2020-10-09 17:21

　　 [目的]初步探究乙肝核心蛋白(HBc-N144)嵌合奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)构成的重组蛋白疫苗(HBc-N144-NspA)在小鼠体内诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,特别是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找高效黏膜免疫佐剂、研制高效B群流脑疫苗提供实验依据。[方法]1.构建HBc-N144-NspA病毒样颗粒。通过生物信息学查找及截取乙肝核心蛋白、奈瑟菌表面蛋白A基因序列,在截短的乙肝核心蛋白(HBc-N144)的免疫显性区域(MIR区)79-80位氨基酸之间插入NspA基因,获得测序正确的原核质粒pET28a-HBc-N144-Ns pA,再将该融合质粒表达重组蛋白HBc-N144-NspA,纯化后通过透射电镜观察其所形成的病毒样颗粒。2.评价HBc-N144-NspA重组蛋白疫苗的免疫效果。原核表达的重组蛋白HBc-N144-NspA,纯化后免疫雌性BALB/C小鼠,间接ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a以及生殖道分泌液中sIgA。分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测培养上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A含量;流式细胞术检测脾淋巴细胞Th1和Th2亚群。血清体外杀菌试验检测免疫血清的体外杀菌活性;末次免疫后2周,以致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58攻击,观察疫苗的免疫保护效果。通过采集小鼠免疫接种部位肌肉组织进行病理切片分析炎性浸润情况。[结果]1.成功构建了HBc-N144-NspA病毒样颗粒。通过透射电镜观察HBc-N144、HBc-N144-NspA呈颗粒样结构,它们大小较均一,粒径分别约为30nm及120nm;2.重组蛋白疫苗组HBc-N144-NspA+F(F为弗氏佐剂)、HBc-N144-NspA和rNspA+F分别免疫小鼠所产生的特异性IgG和sIgA在免疫后42天达到峰值,其中HBc-N144-NspA组明显高于rNspA/F组(p0.05),HBc-N144-NspA+F和HB c-N144-NspA组之间相比无显著性差异(p0.05)。HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA,NspA+F组特异性IgG1/IgG2a比值均大于1。流式细胞术结果显示,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA和Nsp A+F诱导的免疫应答均倾向于Th2型。细胞因子水平的定量检测结果显示,HBc-N144-NspA+F和HBc-N144-NspA组所产生的IL-4、I NF-γ和IL-17A水平无明显差异,但均高于NspA+F组。致死量MC58攻击试验小鼠72h后,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA组均获得了良好的免疫保护效果,小鼠存活率均达90%,明显高于r NspA+F组75%的存活率。免疫后第六周血清体外杀菌抗体滴度,H Bc-N144-NspA+F组为1:16,HBc-N144-NspA和rNspA+F均为1:8。病理切片结果显示,HBc-N144-NspA+F组与NspA+F组均出现明显的炎性细胞浸润,而HBc-N144-NspA组未产生明显的炎性浸润。[结论]1、构建的HBc-N144-NspA病毒样颗粒具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生较高水平的特异性体液免疫,尤其是黏膜免疫。2、HBc-N144-NspA重组蛋白疫苗组血清体外杀菌活性较高,对实验小鼠有较强的保护作用,且免疫保护效果明显高于NspA+F组。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：

第 4 章 实验结果第 4 章 实验结果4.1 HBc-N144-NspA 构建以及 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的表达、纯化及 Western blot 鉴定4.1.1 嵌合蛋白 HBc-N144-NspA 结构图通过查询 GeneBank 找到 HBV 碱基序列以及 NspA 碱基序列，通过比对筛选出乙肝核心蛋白氨基端前 144 位氨基酸，该 144 位氨基酸是主要的衣壳蛋白装配区域，本研究通过将 NspA 插入到衣壳蛋白装配区域中的免疫显性区，位于 78-79 位氨基酸之间，并且为了进行 Ni+层析柱纯化，在构建过程中将 His标签添加到该嵌合蛋白 C 端（图 4.1.1）。

22图 4.1.2 NspA 以及 HBc-N144-NspA 三维结构预测Fig 4.1.2 The NspA and HBc-N144-NspA proteins were predicted and modeledby PHYRE 2.Notes: Six views (Front, Back, Left, Right, Upper and Under) of the predictedstructures were presented by chimera 1.12.4.1.3 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的表达、纯化原核质粒rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA分别加IPTG诱导表达6h, 表达的蛋白采用 Ni-NTA 亲和层析技术纯化，收集目的蛋白经 SDS-PAGE 分析，得到相对分子质量 HBc-N144(16kDa)、HBc-N144-NspA(37 kDa)以及 rNspA(26kDa)相符的目的条带（图 4.1.3）。

图 4.1.3 HBc-N144, rNspA, HBc-N144-NspA 的 SDS-PAGE 分析（15%凝胶）Fig 4.1.3 Analysis of the recombinant proteins HBc-N144, rNspA,HBc-N144-NspA by SDS-PAGE. Lane M: protein molecular weight marker in kDa;(A) Lane 1: uninduced bacteria expressing HBc-N144; Lane 2: induced bacteriaexpressing HBc-N144; Lane 3: purified HBc-N144; (B)Lane1: induced bacteriasupernatant expressing HBc-N144-NspA; Lane 2: induced bacteria sedimentexpressing HBc-N144-NspA; Lane 3-5: purified HBc-N144-NspA with serialconcentration of elution buffer. (C) Lane 1-5: purified rNspA4.1.4 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的 Western blot 鉴定纯化的 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 经 Western blot 分析（一抗：鼠抗 rNspA 血清, 抗 HBc-N144 血清, 抗 HBc-N144-NspA 血清；二抗：山羊抗鼠IgG），在约 16 kDa、26 kDa 以及 37kDa 处观察到清晰的特异性条带（图 4.1.4）。

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本文编号：2833971