金黄色葡萄球菌gdpS调控毒性因子spa的机制研究

发布时间：2020-10-12 19:01

　　 金黄色葡萄球菌是人类的机会性致病菌,可造成浅层皮肤感染和危及生命的侵染疾病。金黄色葡萄球菌的毒性由多种毒性因子决定,这些毒性因子响应于外界环境变化,受到一系列调控因子的精确调控。Protein A是金黄色葡萄球菌中重要的表面蛋白质,能够与哺乳动物免疫球蛋白IgG的Fc区域结合,帮助细菌进行免疫逃逸。在金黄色葡萄球菌中,spa受到多元调控因子和复杂的网络调控。环二鸟苷酸c-di-GMP是细菌中普遍存在的第二信使,能够参与多种病原体中生物被膜的形成,以及毒性调控等。C-di-GMP一般由含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶环化两个GTP分子而成,并由含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶水解成pGpG或两个GMP分子。在不同菌株中含GGDEF、EAL和HD-GYP结构域的蛋白质数量均有差异,但在金黄色葡萄球菌NCTC8325中,只发现一个编码保守GGDEF结构域的基因gdpS,且并未发现含EAL或HD-GYP结构域的基因存在。近期的研究发现在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中,GdpS不参与c-di-GMP的合成,而根据我们研究中的芯片分析结果,gdpS的失活将引起一系列毒性因子的变化,特别是protein A及它的上游调控因子SarS,并且与野生型菌株相比,sarS与spa在gdpS敲除株中呈现相同趋势的转录水平变化。因此我们推测gdpS可能通过影响sarS的表达以实现对spa的调控作用。在前期研究中,我们首先发现gdpS对spa和sarS的影响主要依赖于其N端结构域,而不是C端结构域,证明gdpS的调控功能与c-di-GMP无关。因此在本研究中,我们首先利用定点突变与回补实验,对gdpS的起始密码子进行突变或是删除,并通过荧光定量PCR证明gdpS的蛋白产物不参与sarS的转录调控。之后,我们利用Northern blot检测gdpS上可能存在的转录本,排除了gdpS编码转录sRNA的可能性,并通过凝胶阻滞实验分析证明gdpS mRNA可通过直接的RNA-RNA相互作用与sarSmRNA的5'UTR进行碱基配对。同时,我们也根据序列比对预测出gdpSmRNA与sarSmRNA上可能发生配对的18个碱基区域,并利用定点突变与回补实验对这18个碱基进行不同长度的突变,最后结合荧光定量PCR与酶活实验证明这18个碱基区域,在此调控过程中发挥重要功能。此外,我们利用利福平阻断金黄色葡萄球菌中RNA的转录,通过荧光定量PCR进行sarSmRNA半衰期的检测,发现在gdpS敲除株中,sarS mRNA的半衰期明显低于野生型与回补株,这一变化显示gdpS能够通过增强mRNA稳定性的方式,提高胞内mRNA的水平,证明gdpS可能最终通过一种调控RNA的方式影响sarS与spa的表达水平。这一机制的发现不仅有助于对毒性因子spa调控网络的进一步了解,同时阐明gdpS mRNA为金黄色葡萄球菌中最新发现的双功能RNA,为其它菌株中调控RNA的研究提供了思路。此外,在其它菌株中同样存在某些缺少DGC或PDE酶活性的含GGDEF和EAL结构域的蛋白质,这些蛋白质常具有其它与c-di-GMP无关的生物学活性,对gdpS功能的发现将有助于对这些基因功能的研究。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R378.11
【部分图文】：

在希腊语中如ｅ意为葡萄串，ＣＯＣＣ／意为球巧细菌，在拉了语中??ｏｗｅｗ化表金色，表明金黄色葡萄球菌为生长呈金黄色葡萄串状的球状菌（如??图１．１）。金黄色葡萄球菌为兼性厌氧微生物，细胞直径约为１?ｙｍ，革兰氏染色??阳性。金黄色葡萄球菌细胞壁结构复杂，由肤聚糖、磯壁酸和多糖等组成，可??帮助细胞抵御高压环境，且使抗菌药物难Ｗ进入细胞，这也是金黄色葡萄球菌??感染难Ｗ治疗的原因之一。金黄色葡萄球菌可在广泛的ＰＨ范围内生存，抗干??旱，耐高盐，能够在极端温度６０?°Ｃ下存活３０?ｍｉｎ，在不适于生存的条件下，??金黄色荀萄球菌也能够Ｗ休眠状态存活数年。??？圍誦??图１．１电镜下的金黄色葡萄球苗（Ｋａｈｌｅｔａｌ．，２０〇３）??注；图ａ为透射电子显微镜下金黄色葡萄球菌细胞分裂状态，图ｂ为低倍（６７００Ｘ）??扫描电子显微镜下金黄色葡萄球菌状态，图Ｃ为高倍（３５０００Ｘ）扫描电子显微??镜下金黄色葡萄球菌状态。??金黄色葡萄球菌通常寄生在恒湿动物的皮肤和黏膜表面

?巧疮、烫伤样皮肤综合征、鼻窦炎、也内膜炎、肺炎、骨髓炎、中毒性休克综??合症和败血症等疾病在内的多种感染，严重时甚至可造成死ｔ?（如图１．２）（Ｃｏｉｉｄｅ，??１９９８；Ｐａｎｉｚｚｉｅｔａｌ．，２０１１）。金黄色葡萄球菌可Ｗ产生多种毒性因子，如溶血素、??凝固酶和杀白细胞素等，这些毒性因子决定其致病性的强弱。近年来耐药菌的??出现，也使得金黄色葡萄球菌的预防和治疗更加困难。??妨??帥ｘ？－Ｅ严Ｖ八避严３??ｒＳｉｍｒ－．．?＞－Ｌｗｈｎｏｄｔｓ??Ａｒｔ该贿ｓ?—苗麥?＼￣￣｜Ｌｕｎ§￥?Ｉ??姆顚??山汾＿’觀＇Ｉ献觸嗎麵??論幽ｒ．？，Ｖ＞．?禪Ｓ議補??佑?ｄ。巧昨?＾?Ｖ＾ｍ??Ｓｋｅｌｅｔｏｎ?Ｐａｒｓｃｒｅａｓ??虹跑ｉｌ酱」＾?庐?Ｕｒｉｎａｒｙ?Ｗａｄｄａｒ??ｉｉ?＼?＼??图１．２金黄色葡萄巧茵诱发的多种感染（Ｍｉｋｅａｌ，２０１４）??注：金黄色葡萄球菌可在人体的《个组织和器官中诱发感染。其中最为常见的为在皮??肤引起的浅层或深层感染，在屯、脏处引起的屯、内膜炎，在肺部引起的肺炎，在骨??髓引发的骨髓炎，化及由肠毒素等毒性因子在小肠引起的肠炎等。??１丄２金黄色葡萄球菌的进化??金黄色葡萄球菌群的基因组一般表现为环状染色体

多位点序列分型（ｍｕ帕ｌｏｃｕｓ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｔｙｐｉｎｇ，?ＭＬＳＴ）为?ＳＴ８，?基因??分型为ｔ２１１，研究过程中可通过与不同临床流行菌株的比较，进行针对性和特??异性的研究（如图１．３）?（Ｗｕｅｔａｌ．，２０１０）。随着测序和芯片等技术的发展，现已??有多种方法来了解金黄色葡萄球菌的基因组、进化方式和其对压力环境如抗生??素等的适应过程。然而，现今关于金黄色葡萄球菌基因组的变化仍存在许多未??知，对菌株进化过程的研究，对人类健康至关重要，可为未来感染的预防和治??疗提供方向。??＾?＾?舞狱赖３。燃觀。掛脚??ｇ?ｇ?８１?至ｉ?ｇ?ｉｉｉｉ?８妻《玄秀票旁￥运??Ａ集?！?ＩＨ蒙?含Ｉ?Ｈｉ！八攪?ＣＷ只勒Ｕ０?資；㈱８寒巧?Ｒ巧Ｒ窃ａ持穿Ｓ?Ｓ?Ｓ???ＨＩ?Ｉ?Ｊ｜?Ｉ?零！?巧Ａ＜：０?０４巧ＳＡ１０?４?！Ｖａ?｜?微８?ＳＴＢ?ＣＣ８?Ｒ?Ｓ?Ｒ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?８?＾的姑贿??Ｊ?１．?扮微絲巧中Ｗ身！?禱沒巧?ＣＣ８?Ｒ巧Ｒ沒Ｓ?Ｒ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｊ??＾?１?Ｉ?Ｉ?Ｉ?｜｜?ｉ?１；１｜。心．了说３錫?Ｗ鸿?－ｍ?＼泛＂容ｒｓ?ＣＣ８?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ化巧嚇Ｓ?Ｓ芽巧折货令。巧??？?．?；?
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本文编号：2838147