第一部分外源性一氧化氮对大鼠慢性胃溃疡的保护作用目的:迷走神经在胃肠道炎症发生时通过胆碱能抗炎症反射(Cholinergic anti-inflammation reflex,CAIF),又称炎症反射(Inflammation Reflex)调节和控制免疫反应,抑制炎症水平,但在胃肠道发生炎症时局部迷走神经末梢被激活的传入通路尚不清楚。多项研究表明NO在胃溃疡的发生中发挥保护作用,但机制尚不明确。有研究提示一氧化氮能够间接激活消化道迷走神经末梢,然而尚没有直接证据表明其参与胆碱能抗炎反射。本研究的目的是证实外源性一氧化氮对胃溃疡的保护作用是直接激活迷走神经,同时探索其可能的机制。方法:通过胃壁浆膜下注射冰醋酸的方法诱导大鼠慢性胃溃疡模型。通过腹膜腔注射NO外源性供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP),或者预先膈下迷走神经切除术后腹膜腔注射SNP,或者联合注射SNP及TRPV1通道阻断剂(capsazepine,CZP)干预溃疡的形成。术后第四天处死动物通过测量溃疡面积、组织切片HE染色、组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性检测等方法评估炎症水平。结果:1. SNP对溃疡面积、宏观形态的影响腹膜腔注射SNP对胃黏膜组织的充血、水肿及溃疡形成有明显改善作用,溃疡面积明显减小,由1. 16 ± 0. 12 mm2减小到0. 74 ± 0. 12 mm2 (P 0. 05,n = 6),同时注射CZP、或膈下迷走神经切断术后,SNP的作用消失。2. SNP对胃组织组织学表现的影响冰醋酸对照组可见胃黏膜下层结构破坏,出血及渗出,炎性细胞浸润。腹膜腔注射SNP后炎症表现明显减轻,同时注射CZP、或膈下迷走神经切断术后,SNP的作用消失。3. SNP对胃组织内MPO活性的影响冰醋酸对照组大鼠胃组织的MPO活性比生理盐水对照组明显增高(1.79± 0. 37 U/g vs 0.23 ± 0.05 U/g,P 0. 05,n = 6)。经 SNP 连续腹膜腔注射4天后,胃的MPO活性显著降低(P0.05,n = 6)。同时注射CZP、或膈下迷走神经切断术后,SNP的作用消失。结论:外源性NO对冰醋酸诱导的大鼠慢性胃溃疡的发生发展起到保护作用,这种作用是通过迷走神经实现的,提示NO可能参与迷走神经抗炎反射的传入通路,并且TRPV1通道可能参与这个过程。第二部分外源性一氧化氮对大鼠肠系膜传入神经放电的影响及其机制目的:研究发现,NO主要有以下两种信号途径:经典的环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-PKG通路,以及不依赖于cGMP的亚硝基化(S-nitrosylation)途径。目前,亚硝基化被认为是一种与磷酸化相似的新的信号转导调控机制。通过亚硝基化,NO可以调控多种离子通道的活性。研究证实一氧化氮能够间接激活消化道迷走神经末梢,然而尚没有证据表明其可以通过直接的硝基化作用激活肠系膜传入神经。作为硝基化修饰的靶点之一,TRPV1在消化道迷走神经传入末梢也有丰富表达。有研究表明TRPV1在炎症中也发挥重要作用。本研究的目的是探索外源性一氧化氮对肠系膜传入神经放电的直接作用及其机制,以期揭示NO在传入神经水平的抗炎作用机制。方法:利用离体肠系膜传入神经电活动记录分析技术记录SNP对离体雄性大鼠、小鼠和TRPV1--小鼠空肠传入神经生物电活动的影响,并用单信号分析(Single Unit Analysis)方法分析其对不同类型神经纤维的作用。并分别用膈下迷走神经切断术、巯基保护剂N-ethylmaleimide (NEM)、选择性GC阻断剂1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-l-one (ODQ)、TRPV1 阻断剂 CZP研究SNP的作用机制。结果:1. NO供体SNP对大鼠肠系膜传入神经自发放电的影响待神经放电稳定后,向肠段浆膜面加入4 mM的SNP, 2 min内肠系膜传入神经放电频率明显增加,放电频率差值从1.3 ± 1.2 imp/s增加到48. 5 ±7.3 imp/s (P0.05,n = 6),而低浓度(0.01 mM )的SNP对自发放电并没有显著作用(P 0.05,n = 6),SNP的作用表现出浓度依赖性,半数有效率 ED50为 0. 16 mM。2. NO供体SNP对传入神经中不同神经成分的自发放电的影响用单信号分析(single-unit analysis)的方法,分析到59个机械敏感性传入神经放电信号。其中17个信号发自低阈值神经纤维,一般认为这类纤维为迷走传入纤维;20个信号发自高阈值神经纤维,一般认为这类纤维为脊神经中的内脏痛觉传入纤维;其余22个信号发自宽阈值神经纤维。SNP增加了低阈值神经纤维的自发放电水平(P 0.05),但对高阈值的纤维成分没有影响。3.膈下迷走神经切断术对SNP作用的影响大鼠在麻醉状态下行膈下迷走神经切断术,14天后牺牲动物,取出空肠,用含0.16 mM SNP的柯氏液预孵育后,迷走神经切断手术组的大鼠传入神经放电频率增加值降低到2. 6 ± 0. 4 imp/s,明显低于假手术组(26. 9 ± 5. 2 imp/s,P 0.01, n = 6) 。4.巯基保护剂及选择性GC阻断剂对SNP作用的影响在器官浴槽中加入NEM (5 mM)预孵育15 min后,SNP不再引起肠系膜传入神经自发放电的增加,NEM组加入SNP后放电频率增加值比DMSO组明显降低,从 23. 4 ± 5. 2 imp/s 降至 0. 2 ± 5. 7 imp/s (P0. 05,n = 6);然而ODQ(10 μM)预孵育10min并不影响SNP的作用(P=0.52,n = 6)。5. TRPV1通道阻断剂、基因敲除对SNP作用的影响及SNP对辣椒素敏感性的影响空肠标本用含CZP (50 μM)的柯氏液预孵育10 min后,SNP诱发放电增加较DMSO对照组明显降低,从25. 8 ± 5. 6 imp/s降至8. 4 ± 4. 1 imp/s(P 0.05,n=6)。SNP和辣椒素具有明显的协同作用,两者共同作用所引起的传入神经放电频率增加值从8.2 ± 1.8 imp/s (辣椒素的单独作用)增加至 20.9 ± 2.7 imp/s (P 0. 05,n = 6)。SNP 对 TRPV1 基因敲除小鼠肠系膜传入神经放电的作用远低于野性型小鼠(P0.001, n = 6)。结论:SNP通过激活大鼠空肠肠系膜传入神经中的迷走神经纤维末梢,上调其自发放电的频率,该作用主要是通过巯基亚硝基化作用实现的,TRPV1通道参与了这一过程。第三部分外源性一氧化氮对大鼠结状神经节和背根神经节神经元电活动的影响及其机制目的:前期实验证实SNP通过巯基亚硝基化作用激活肠系膜迷走神经传入纤维,且在这个过程中有TRPV1通道的参与。为了进一步证实SNP对迷走神经的选择性激活作用,并验证TRPV1是巯基亚硝基化的靶点,我们在神经元水平进行电生理实验,进一步研究SNP的作用及其机制。方法:分离大鼠结状神经节(nodose ganglion,NG)、T7 - L5节段的背根神经节(dorsal root ganglion, DRG),消化分离出单个神经元细胞后接种于玻片上。利用全细胞膜片钳记录神经元细胞静息膜电位、辣椒素(capsaicin,CAP)激发膜电流,电信号通过Axon膜片钳放大器和A/D转换器记录入计算机,使用Clampex10. 2软件进行信号采集和分析。结果:1. NO供体SNP对NG神经元细胞静息膜电位的影响NG 细胞的静息膜电位为-57.4 ± 1.3 mV (n = 43)。SNP (0.16 mM)使NG细胞膜发生明显去级化(P 0.05,n = 7),经细胞外液冲洗可部分恢复,低浓度的SNP (0.016 mM)不影响NG神经元的膜电位。2.巯基保护剂及选择性GC阻断剂对SNP作用的影响用含巯基保护剂NEM (5mM)的细胞外液孵育NG细胞15min后,SNP引起膜去极化的作用明显减低(P0.01, n= 7)。然而选择性GC阻断剂ODQ(10 μM)预孵育10 min并不影响SNP的作用。3. TRPV1通道阻断剂对SNP作用的影响用TRPV1阻断剂CZP (50 μM)孵育NG细胞10 min后,SNP引起膜去极化的作用明显减低(P 0.05,n = 7)。4. SNP对NG神经元细胞辣椒素电流的影响SNP (0.16 mM)显著增加NG细胞中辣椒素诱发的内向电流(capsaicin-induced inward current,Icap)的幅度,电流峰值从-609. 4 ± 88.0 pA 增加至-1224.3 ± 202. 1 pA (P 0.05, n = 7)。NEM (5 mM)孵育显著降低SNP的作用,而ODQ (10 μM)对其没有明显影响。5. SNP对DRG神经元细胞静息膜电位的影响SNP (0.0016 - 0. 16 mM)使DRG细胞膜电位发生超级化(P 0.05,n = 7),经细胞外液冲洗可恢复至静息膜电位水平,呈现浓度依赖性。结论:SNP能够通过巯基亚硝基化作用激活NG神经元上的TRPV1通道,并提高神经元细胞对辣椒素的化学敏感性,提示TRPV1是亚硝基化的直接靶点。SNP对DRG的作用与之相反,证实了 SNP对迷走神经传入纤维的激活作用具有特异性。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R573.1;R-332
【部分图文】：
图１?ＳＮＰ对胃溃疡宏观形态的影响。??ｉ为生理盐水对照组，ｉｉ为冰醋酸对照组，ｉｉｉ为冰醋酸＋ＳＮＰ?（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，??ｂｉｄ）组，ｉｖ?为冰醋酸?＋ＣＺＰ?（１．２ｍｇ／ｋｇ，?Ｌｐ．，ｂｉｄ）组，ｖ?为冰醋酸?＋ＣＺＰ?＋??ＳＮＰ组，ｖｉ为迷走神经切断＋冰醋酸组，ｖｉｉ为迷走神经切断＋冰醋酸＋?ＳＮＰ??组。除生理盐水对照组的胃黏膜完整光滑、无溃疡，其他六组动物的胃黏膜均有??不同程度的充血、水肿及溃疡形成。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｔｈｅ?ｇｒｏｓｓ?ａｐｐｅａｒａｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ?ｉｎ?ｒａｔｓ??ｔｒｅａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ａｃｅｔｉｃ?ａｃｉｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｗａｌｌ?ｏｆ?ｓｔｏｍａｃｈ?ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｗｉｔｈ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ?ｏｆ??ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ．??Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓｉｚｅｓ?ｏｆ?ｕｌｃｅｒ?ａｒｅ?ｓｅｅｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｉｘ?ａｃｉｄ－ｔｒｅａｔｅｄ?ｇｒｏｕｐｓ?ｅｘｃｅｐｔ?ｔｈｅ?ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ，?（ｉ）??ＮＳ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｉ）?ｕｌｃｅｒ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｉｉ）?ＳＮＰ?（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，?ｂｉｄ）?ｇｒｏｕｐ；?（ｉｖ）??
１?２?３?４?５?６?７??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｕｌｃｅｒ?ＳＮＰ?ＣＺＰ?ＣＺＰ＋ＳＮＰ?Ｖａｇｏｔｏｍｙ?Ｖａｇｏｔｏｍｙ＋ＳＮＰ??图２?ＳＮＰ对胃溃疡面积的影响。??冰醋酸对照组大鼠的胃溃疡面积比生理盐水对照组明显增高；冰醋酸的溃疡面积比冰醋酸对照组显著降低。ＣＺＰ没有改变溃疡的面积，但的作用。预先迷走神经切断的大鼠，冰醋酸处理组表现为溃疡面积的注射ＳＮＰ并没有降低溃疡的面积，＊?Ｐ?＜?０．?０５?ｗ生理盐水对照组，ｖｓ冰醋酸对照组，迷走祌经切断＋冰醋酸组样本量《＝?１０，其余六Ｆｉｇｕｒｅ?２?Ｓｕｍｍａｒｙ?ｖａｌｕｅｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｕｌｃｅｒ?ａｒｅａ?（ＵＡ）?ｉｎ?ｔｇｒｏｕｐｓ．??ＳＮＰ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ?ｄｅｃｒｅａｓｅｄ?ＵＡ．?ＴＲＰＶ１?ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ?ｄｉｄｎ’ｔ?ｐｒｏｄｕｃｅ?ｈｉｇｈｅｒｒｅｄｕｃｅｄ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＳＮＰ．?Ｐｒｉｏｒ?ｓｕｂｄｉａｐｈｒａｇｍａｔｉｃ?ｖａｇｏｔｏｍｙ?ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．＝
图３?ＳＮＰ对胃组织形态学表现的影响。??ｉ为生理盐水对照组；ｉｉ为冰醋酸对照组，冰醋酸诱导的大鼠慢性胃溃疡主要表??现为粘膜腺体消失、出血及中性粒细胞浸润、坏死和再生；ｉｉｉ为冰醋酸＋?ＳＮＰ??（３ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，?ｂｉｄ）组，ＳＮＰ减轻了炎症细胞浸润的程度；ｉｖ为冰醋酸＋ＣＺＰ??（１．２?ｍｇ／ｋｇ，?ｉ．ｐ．，ｂｉｄ）组，ｖ为冰醋酸＋?ＣＺＰ?＋?ＳＮＰ组，ｖｉ为迷走神经??切断＋冰醋酸组，ｖｉｉ为迷走神经切断＋冰醋酸＋?ＳＮＰ组，同时注射ＣＺＰ、??预先迷走神经切断均可阻断ＳＮＰ的作用。??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ?ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｅｖｅｎ?ｇｒｏｕｐｓ．??Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＳＮＰ?ｗａｓ?ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ?ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ．?Ａｃｅｔｉｃ?ａｃｉｄ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｅｖｅｒｅ??ｄａｍａｇｅ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｍｕｃｏｓａ，?ｗｈｉｃｈ?ｗａｓ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ?ｂｙ?ｓｕｂｍｕｃｏｓａ?ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，??ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ?ｉｎｊｕｒｙ?ａｎｄ?ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ?ｃｅｌｌ?ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．?Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｕｌｃｅｒ??
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