目的:构建带有增强型荧光蛋白(EGFP)标记的针对大鼠Slfn1(Schlafen1,睡眠因子1)的shRNA(发夹状RNA)干扰载体,并进行腺病毒包装,将其转染至原代培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)48h后,观察Slfn1的沉默表达对VSMCs增殖的影响。方法:1、根据Rat Slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)和1个阴性对照序列NC-shRNA,并将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体(pDKD-CMV-U6-shRNA)的U6启动子下游,替换掉原来的ccdB基因;经菌落PCR筛选转化子,其阳性克隆进行测序验证,将正确的克隆进行高纯度质粒抽提;利用Admax系统,将3种目的穿梭质粒、1种阴性对照穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定;利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag的表达,观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。2、通过组织块贴壁法原代培养VSMCs,应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察,使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。3、使用最适感染复数的shRNA-Slfn1(1)重组腺病毒转染VSMCs 48h后,应用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况,并使用流式细胞仪检测其转染效率,通过PCR检测Slfn1 mRNA的表达,最后使用CCK-8检测Slfn1的沉默表达对VSMCs增殖的影响。结果:1、经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并进行测序验证正确,表明构建质粒成功;经腺病毒包装及病毒扩增与纯化后,shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)及NC-shRNA的病毒滴度分别为1.0x1011 ifu/ml,2.5x1011 ifu/ml,6.3x1010 ifu/ml,5.5x1010 ifu/ml。Western Blot证实shRNA-Slfn1(1)和shRNA-Slfn1(3)能显著降低293T细胞中Flag的表达,确定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)为目的质粒。2、原代培养第4-6天时,部分组织块周围开始有长梭形细胞爬出;第7-9天时,组织块周围细胞爬出较少的呈网状生长,细胞爬出较多的呈漩涡状生长,致密排列呈束状;第10-14天时,细胞呈放射状、典型的“峰—谷”样结构,相互融合达80%左右即可传代,此时传代细胞相比原代细胞生长速度明显加快,细胞变大,折光性减弱。免疫荧光染色鉴定可见VSMCs特异性的α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)表达,表达的阳性细胞数在95%以上。3、shRNA-Slfn1(1)重组腺病毒转染VSMCs48h后,倒置荧光显微镜下的EGFP、流式细胞仪检测的转染效率均达80%以上;PCR结果显示:Slfn1干扰组与Slfn1干扰对照组相比,Slfn1 mRNA表达量明显减少;CCK-8结果显示:使用shRNA-Slfn1重组腺病毒载体降低VSMCs中Slfn1基因的表达后,与对照组相比促进VSMCs的增殖。结论:1、成功构建了大鼠shRNA-Slfn1的重组腺病毒载体。2、shRNA-Slfn1(1)重组腺病毒对原代大鼠VSMCs具有干扰作用且干扰效率较高,干扰VSMCs中Slfn1基因的表达促进VSMCs的增殖。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：Q78;R329.2
【部分图文】：
图 1-1 穿梭质粒图谱Fig. 1-1 Map of Shuttle plasmidAgeI 和 EcoRI 酶酶切 U6 启动子下游的 ccdB 毒性基因，酶
对照（空载体质粒）；2 为 DNAMarker,从上到下的方向依次为 2 000 100 bp；3~10 为挑取的 8 个转化子。图 2-2 菌落 PCR 鉴定阳性克隆Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.
Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.2.2.2 测序鉴定重组穿梭质粒挑取阳性克隆进行测序验证，通过 Chromas 测序软件分析显示所插入的 3对 shRNA 及 1 对对照序列与设计序列完全一致，表明目的穿梭质粒构建成功：
【参考文献】
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2839951
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