基于NF-κB信号通路甲型流感病毒血凝素1诱导小鼠气管上皮细胞β-防御素产生机制的研究

发布时间：2020-10-14 05:51

　　 目的:探讨重组甲型流感病毒H1N1血凝素1(Hemagglutinin 1,rHA1)对小鼠原代气管上皮细胞产生β-防御素(β-defensins,BD)的作用,以及基于NF-κB信号通路的作用机制。方法:培养小鼠原代气管上皮细胞,细胞分组为:正常对照组和实验组。实验组包括:rHA1组(200ng/mL)、病毒组(2×TCID50)、灭活病毒组、rHA1+病毒组、rHA1+灭活病毒组;另设抑制组,即在相同的实验条件下提前1h给予NF-κB的抑制剂PDTC(Pyrrolidine dithiocarbama,吡咯烷二硫基甲酸盐,PDTC)20μM,再分别加入各组制剂。分别作用细胞4h、8h、24h后,HE(Hematoxylin-Eosin staining,苏木精-伊红染色法,HE)染色观察细胞的形态学变化;收集细胞,提取细胞内容物、蛋白质和RNA,通过qRT-PCR、Western blot和ELISA方法检测各组mBD2~4、IFN-γ、NF-κBp65、NF-κB P-p65、NF-κBp50、NF-κB P-p50、NF-κB IκB、NF-κB P-IκB各指标的基因和蛋白表达情况。结果:1.HE染色结果显示:作用4h、8h、24h后,各实验组细胞与正常组细胞相比,细胞胞浆中出现大小不一的空泡、部分细胞核固缩及合胞体等细胞形态学变化。2.qRT-PCR实验结果显示:各实验组细胞与正常组细胞相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表达上调,rHA1+病毒组与病毒组相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表达上调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表达上调。PDTC(20μM)作用细胞后,与未加抑制剂的相应实验组比较,Mbd2~4、IFN-γ基因表达下调,rHA1+病毒组与病毒组相比Mbd2~4、IFN-γ基因表达下调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比Mbd2~4、IFN-γ基因表达下调。3.Western blot实验结果显示:各实验组细胞与正常组细胞相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表达上调,rHA1+病毒组与病毒组相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表达上调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表达上调。PDTC(20μM)作用细胞后,与未加抑制剂的相应实验组比较,rHA1+病毒组与病毒组相比,IFN-γ蛋白表达下调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比,IFN-γ蛋白表达下调。4.ELISA结果显示:各实验组细胞与正常组细胞相比,mBD2~4蛋白表达上调,rHA1+病毒组与病毒组相比,mBD2~4蛋白表达上调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比,mBD2~4蛋白表达上调。PDTC(20μM)作用细胞后,与未加抑制剂的相应实验组比较,mBD2~4蛋白表达下调,r HA1+病毒组与病毒组相比,mBD2~4蛋白表达下调,rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组相比,mBD2~4蛋白表达下调。结论:1.甲型流感病毒重组rHA1能够单独或协同活的/灭活流感病毒诱导mBD2~4、IFN-γ的表达作用。2.甲型流感病毒rHA1单独或活的/灭活流感病毒诱导小鼠气管上皮细胞mBD2~4、IFN-γ的表达上调作用与NF-κB信号通路有关。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R373
【部分图文】：

19图 2-1 流感病毒 rHA1 作用小鼠气管上皮细胞的 HE 染色结果（400×）Fig.2-1 The HE staining of Influenza virus rHA1 on mouse tracheal epithelial cell.图注：HA1 组（HA1），HA1+病毒组（HA1+IAV），病毒组（IAV），HA1+灭活病毒组（HA1+I），灭活病毒组（I），正常组（C）。黑色箭头表示：细胞变性变化2.3 流感病毒 rHA1 对小鼠气管上皮细胞基因检测指标表达的影响rHA1 组、病毒组、灭活病毒组、rHA1+病毒组、rHA1+灭活病毒组、正常对照组。分别作用于 4h、8h、24h 其表达情况如下：2.3.1 Mbd2 检测结果:如图 3-1A 所示 4h rHA1 组与正常组比较 Mbd2（t 值-163.0,P<0.05）基因诱导表达上调，rHA1+病毒组与病毒组比较诱导 Mbd2（t 值-46.063,P<0.05）表达上调，rHA1+灭活病毒组与灭活病毒组比较诱导 Mbd2（t 值-21.913,P<0.05）表达上调。如图 3-1 B 所示 8h rHA1 组比正常组的 Mbd2（t 值-545.0,P<0.05）基因
【参考文献】

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本文编号：2840282