基于致倦库蚊转录组的溴氰菊酯抗性相关基因分析

发布时间：2020-10-16 22:51

　　 目的通过对致倦库蚊溴氰菊酯敏感株和抗性株进行转录组分析,筛选可能与抗性相关的差异表达基因。方法对致倦库蚊实验室敏感株(SS株)、海南株(HN株)和溴氰菊酯药筛抗性株(RR株) 3个不同抗性水平的株系进行生物测定,分别构建3个株系的cDNA文库,提取RNA,进行转录组测序。基于FPKM值进行差异性分析,对差异基因进行GO和KEGG功能注释与富集分析。筛选出致倦库蚊不同株系中表达量有显著性差异的基因,并采用实时定量PCR验证。结果生物测定结果显示,与致倦库蚊SS株相比,HN株和RR株的抗性倍数分别达到了4 828倍和197 241倍,为高等抗性水平。RNA-seq测序结果显示,致倦库蚊SS株、 HN株和RR株转录组共注释基因转录本197 079个。GO富集分析结果显示,在结合、催化活性、细胞过程、代谢过程、单一生物过程、细胞、细胞连接、细胞器中基因富集数量较多。KEGG富集分析结果显示,在富集度最高的前20个条目中,RR株主要富集于剪接体、核糖体等通路,HN株则主要富集于剪切体、 RNA转运、 hedgehog信号通路、细胞周期、核苷酸切除修复、 DNA复制等方向。基于FPKM值的差异性分析结果显示,致倦库蚊RR株和HN株较SS株均上调的有5 357个,均下调的有10 978个。与溴氰菊酯抗性相关基因的靶向性筛选结果显示,与SS株相比,RR株和HN株注释的细胞色素P450基因、谷胱甘肽转移酶基因、气味结合蛋白基因、气味受体基因、视觉基因、核糖体蛋白基因和碳酸酐酶基因转录本中,均上调的分别为100、 17、 13、 4、 16、 191和1个,均下调的分别为253、 48、 43、 4、 15、 504和9个。从上调基因中挑选的12个基因(2个细胞色素P450基因、 1个谷胱甘肽转移酶基因、 1个视觉基因、 1个核糖体蛋白基因、 1个碳酸酐酶基因、 1个核酸内切酶基因、2个气味结合蛋白基因、 3个气味受体基因)进行实时定量PCR验证结果显示,在RR株和HN株中,这12个基因较SS株均显著上调,其中RR株较SS株上调1.62～80.26倍,HN株较SS株上调2.01～189.48倍。相关性分析结果显示,12个目标基因的RNA-seq结果与实时定量PCR结果在HN株和RR株中均呈正相关(r=0.802、0.710)。证明这12个目标基因的实时定量PCR结果与转录组测序结果趋势一致。结论基于高通量测序结果和定量PCR验证分析,致倦库蚊中的某些细胞色素P450基因、谷胱甘肽S转移酶基因、视觉基因、嗅觉蛋白基因可能在其对溴氰菊酯的抗性中起一定作用。
【部分图文】：

2.8 RT-PCR对高通量测序结果的验证从2.6分析结果中选择12个转录组测序结果中上调的基因包括细胞色素P450基因（P45011A1、P4506B1）和谷胱甘肽S-转移酶GSTD2等常见抗性基因，以及某些待验证的可能参与蚊虫抗性的基因，如视觉基因opsin-1、CA基因、气味结合蛋白（odorant-binding protein,OBP）基因（OBP45、PBP）、气味受体（odor receptor,OR）基因（OR7a、OR10a、CPIJ006795）、核糖体蛋白（ribosomal protein S14p/S29e、SAE2）等，进行实时定量PCR验证（图3）。

与SS株相比，OBP45(CPIJ008158）和PBP(CPIJ019750）两个嗅觉基因验证结果显示，这两个基因在HN株的表达量分别上调2.71和2.72倍（t=-6.240、-11.610，均P<0.01）；在RR株中，表达量分别上调2.79和1.95倍（t=-10.458,P<0.01;t=-3.490，均P<0.05）。图3 致倦库蚊3个不同株系的目标基因差异性表达验证

图2 致倦库蚊转录组测序的KEGG显著差异富集分析结果OR7a(CPIJ017139）、OR10a(CPIJ018787）和CPIJ006795基因3个OR基因验证结果显示，在HN株中，这3个基因分别较SS株上调7.34、4.65、2.38倍（t=-5.287、P<0.01;t=-4.490、-5.480,P<0.05);RR株较SS株分别上调了2.41、4.65、2.92倍（t=-6.681、-7.569、-33.198，均P<0.01）。
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