基于CD169表达水平的小鼠脾红髓巨噬细胞分型研究

发布时间：2020-10-17 15:56

　　 目的·基于小鼠脾红髓巨噬细胞唾液酸黏附蛋白(sialoadhesin,Sn)即CD169分子的表达水平,研究CD169~(+ )和CD169~-红髓巨噬细胞亚群的基因表达谱差异。方法·采用流式细胞术和免疫荧光法检测C57BL/6J野生型(WT)小鼠脾红髓巨噬细胞中CD169的表达,以CD169敲除(CD169 KO)小鼠为阴性对照。富集F4/80~+的脾红髓巨噬细胞并分选出CD169~(+ )和CD169~-2个亚群,进行RNA测序。利用DESeq2软件以P0.05且|log_2FC|≥1为条件筛选出差异表达基因,通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes,KEGG)功能分析,将差异基因按照参与的通路或功能进行分类。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)验证部分差异基因。结果·流式细胞术和免疫荧光法证实部分红髓巨噬细胞表达CD169。CD169~+ 和CD169~-亚群拥有485个差异表达基因。一些与介导炎症相关的基因在CD169~-亚群中高表达。结论·CD169~(+ )和CD169~-红髓巨噬细胞有不同的转录谱,CD169~-红髓巨噬细胞亚群具有更多M1型巨噬细胞的特征。
【部分图文】：

为了验证野生型(wild type,WT)小鼠部分RpMΦ表达CD169分子,本研究先利用流式细胞术检测WT小鼠和CD169 KO小鼠脾中RpMΦ的比例,再比较RpMΦ中CD169分子的表达情况。根据已有的研究[22-23]表明,F4/80+ CD11b-可作为RpMΦ的表面标志物。因此,如流式细胞术策略(图1A)所示,在圈选了脾细胞并去黏连后,F4/80+ CD11b-细胞群即为RpMΦ。结果显示,CD169 KO小鼠脾内RpMΦ的比例与WT小鼠相似(图1B),2组小鼠RpMΦ占脾细胞的比例均在0.5%～1.5%,差异无统计学意义(图1C);但以CD169 KO小鼠作为阴性对照,在WT小鼠RpMΦ中可明显地观察到部分RpMΦ表达CD169分子(图1B、D)。2.2 CD169+ RpMΦ的空间分布

为进一步确认CD169在小鼠脾RpMΦ中的表达,本研究利用免疫荧光技术对脾RpMΦ上CD169表达情况进行检测,结果(图2)显示,在白色虚线内侧边缘(边缘区)存在一圈高表达CD169(红色)的MMMΦ;在脾红髓中CD169呈散在分布,并与部分F4/80+的RpMΦ有很好的共定位。由此再次证实,部分RpMΦ可表达CD169分子。同时,结果还发现F4/80主要分布于圆形区域以外的红髓区域,在边缘区有微量的表达,但其荧光强度明显低于红髓区域。2.3 CD169+和CD169-红髓巨噬细胞差异表达基因分析

为探究CD169+ RpMΦ与CD169-RpMΦ在基因表达水平的差异,本研究通过富集RpMΦ,分选出CD169+和CD169-2个亚群,提取RNA并进行测序分析。在CD169+ RpMΦ群中检测到9 234个基因,CD169-RpMΦ群中检测到9 812个基因,其中共同表达的基因有8 866个(图3A)。主成分分析显示,2群细胞可以被很好地区分开(图3B)。对差异基因进行聚类分析显示,共有485个差异表达基因,且相比于CD169+ RpMΦ,在CD169-RpMΦ中的上调基因为427个,下调基因为58个(图3C)。如表达量差异散点图所示,Siglec1(编码CD169的基因)在CD169+ RpMΦ群中高表达(图3D),认为RNA测序结果与分选策略一致;同时,2群细胞共同表达小鼠脾RpMΦ的特征基因,如Vcam1、Axl、Spic、Cd68和Ccr3等,表明这2群细胞均属于RpMΦ。2.4 CD169-红髓巨噬细胞的促进炎症作用
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本文编号：2845005