体液免疫应答的调控新机制和病理意义研究

发布时间：2020-10-17 16:53

　　 体液免疫应答在抵御胞外菌和病毒感染中发挥重要的作用,同时也是临床多种抗体相关自身免疫性疾病发病的关键因子,深入了解体液免疫应答的调控机制无论是对免疫学基础理论还是临床疾病的诊治都具有重要的意义。本论文主要围绕两个先前在体液免疫应答调控中作用未知的分子-程序性死亡受体1(program death-1,PD-1)和富含亮氨酸重复序列激酶2(Leucine-rich repeat kinase2,LRRK2)参与体液免疫应答的调节机制开展系统研究。PD-1,又名CD279,首次是在死亡T细胞杂交瘤细胞中被鉴定出来。PD-1是含有268个氨基酸的I型跨膜蛋白,属于CD28/CTLA-4家族,是T细胞功能的重要反馈调节分子。PD-1在T细胞上诱导性表达,通过与表达于抗原递呈细胞、造血细胞及非造血细胞表面的配体PD-L相互作用进而弱化TCR信号通路的活化。以PD-1/PD-L1为靶点的阻断抗体可以通过提高CD8~+T细胞的免疫功能增强其抗肿瘤作用,并在多种肿瘤的临床治疗中具有很好疗效。然而,PD-1/PD-L1信号通路在体液免疫应答中的作用还需进一步研究。为此,我们利用卵白蛋白(OVA)免疫小鼠的实验模型,采用PD-1阻断抗体处理小鼠,观察其对体液免疫应答的影响。结果显示PD-1阻断抗体处理的OVA免疫小鼠体内总IgG和OVA特异性IgG的含量显著高于未处理组。将NP-CGG免疫小鼠进行PD-1阻断抗体处理后,虽然NP特异性IgG抗体的水平有所升高,但是处理与否对抗体亲和力的成熟没有影响。分析PD-1阻断抗体作用后对OVA免疫小鼠B细胞分化的影响,结果显示,PD-1阻断抗体处理后,OVA免疫小鼠脾脏中与抗体产生密切相关的生发中心B细胞(germinal center B cell,GCB)和记忆性B细胞(memory B cells)的比例显著高于对照组;脾脏和骨髓中抗体产生细胞(antibody secreting cells)的比例也显著升高。为了分析上述B细胞分化过程中亚群分布差异的原因,我们进一步检测了小鼠脾脏生发中心T细胞的分布和数量,结果显示PD-1阻断抗体处理组小鼠脾脏生发中心中CD4~+T细胞的数目显著增多,同时细胞表面ICOS的表达显著升高。进一步探讨阻断PD-1是如何促进ICOS的表达,OVA免疫小鼠来源的脾脏细胞体外经PD-1阻断抗体处理,发现与对照组相比,PD-1阻断抗体处理组培养上清抗体水平以及CD4~+T细胞表面ICOS表达水平均显著升高,并伴随显著增强的ERK信号通路的活化。体外培养中抑制ERK信号通路,可以消除抗体水平的升高和CD4~+T细胞表面ICOS表达水平的差异。此外,临床肺癌病人接受PD-1单克隆抗体治疗后血浆中IgG抗体水平显著高于使用PD-1单克隆抗体前血浆中的IgG抗体水平。综上所述,我们的研究结果表明阻断PD-1信号通路可以增强体液免疫应答,并且一定程度上是依赖于对CD4~+T细胞的ICOS表达水平的上调,而阻断PD-1使ICOS表达水平升高依赖于ERK信号通路的活化。阻断PD-1信号通路对体液免疫应答的调节作用提示了它具有作为肿瘤免疫治疗疗效评判的潜在功能。LRRK2分子最重要的病理作用是在帕金森病人中存在广泛突变,被认为是帕金森病的首个遗传相关因素。LRRK2包含多个潜在功能结构域,包括ROC,COR,激酶,ANK,LRR,WD40等结构域。研究表明LRRK2在多种人免疫细胞,包括B细胞,单核/巨噬细胞和树突状细胞中大量表达。在小鼠也主要是B细胞表达LRRK2,而T细胞并不表达LRRK2,提示LRRK2在免疫系统特别是B淋巴细胞中可能发挥一定的作用。系统性红斑狼疮(SLE)是典型的病理性自身抗体介导的自身免疫性疾病,检测发现SLE病人外周B细胞中LRRK2的表达水平显著高于正常人,并且LRRK2的表达水平与系统性红斑狼疮疾病活动度评分呈显著正相关。同时,LRRK2缺陷显著降低了Pristane诱导的SLE病理模型小鼠外周自身抗体水平,降低肾脏中与病理损伤相关的抗体沉积水平,表明LRRK2在SLE病理性抗体的产生过程中可能具有正向的调节作用。我们进一步通过腹腔注射NP-CGG抗原分别免疫野生型和LRRK2~(-/-)小鼠,结果显示LRRK2~(-/-)小鼠血清中NP特异性抗体的水平显著低于野生型小鼠,而LRRK2分子本身随着B细胞的终末分化,表达水平呈现逐渐上调的趋势。通过骨髓嵌合小鼠实验,发现B细胞中LRRK2基因的缺失是导致小鼠体液免疫应答减弱的原因,体外增殖实验结果显示LRRK2的缺失对B细胞的增殖没有影响。上述结果表明LRRK2在体液免疫反应中具有一定的正向调节作用,该分子可能通过参与调节B细胞的终末分化影响体液免疫应答的结局,并进而在体液免疫应答介导的疾病发生发展中发挥一定作用。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

上海交通大学博士学位论文变（somatic hypermutation），突变后产生的各种 B 力各不相同，经过抗原的不断选择，使表达高亲和力其总体结果是，后代 B 细胞及其产生的抗体对抗原此过程也被称为抗体的亲和力成熟（affinity maturati B 细胞的免疫球蛋白基因发生类别转换（class switcwitch），由此形成包括 IgM、IgG、IgA 和 IgE 在内的通过生发中心反应，活化的 B 细胞最终分化为高亲和LLPCs。

上海交通大学博士学位论文PD-L2 主要表达于胸腺的髓质区域，且可诱导性表达于多种细胞，如 DCs、B 细胞、巨噬细胞、骨髓来源的肥大细胞和记忆性 B 细胞等34。2.2 PD-1/PD-L 信号通路与免疫调控2.2.1 PD-1/PD-L 的信号转导PD-1/PD-L 的信号活化依赖于免疫应答发生后免疫表面 PD-1 的表达上调，并通过与 APC 和其他非免疫细胞上的 PD-L1 结合后，PD-1 胞内段 ITIM 和 ITSM基序中的酪氨酸发生磷酸化，进一步募集胞浆内的 SHP-1 与 SHP-2（主要是SHP-2），SHP-2 可使已经活化的重要信号转导分子，如 PIK3/AKT 及 ZAP70CD3ζ 及下游信号分子 PKCθ 发生去磷酸化，从而抑制活化信号向核内传入以及后续功能基因的表达受到抑制（图 2）38,39。因此，PD-1/PD-L 信号通路的激活成为众多免疫细胞活化后的主要反馈抑制机制。

40图 1-1：OVA 免疫小鼠 CD4+T 细胞表面 PD-1 及 B 细胞表面 PD-L 表达量上升Figure 1-1: Increased expression levels of PD-1 on CD4+T cells and PD-L on B cells upon OVAimmunization(A) OVA 免疫小鼠与未免疫对照组小鼠脾细胞中 CD4+T 细胞上 PD-1 表达水平的流式检测散点图。(B) CD4+T 细胞表达 PD-1 的细胞百分比统计图。(C) OVA 免疫小鼠与未免疫对照组小鼠脾细胞中 B 细胞上 PD-L 表达水平的流式检测散点图。(D) B 细胞表达 PD-L 的细胞百分比统计图。*: P<0.05，**: P<0.01。3.1.2 体内阻断 PD-1 可以增强 TD 抗原免疫小鼠的抗体水平
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本文编号：2845064