人c-myb基因上游远端调控元件的作用机制研究

发布时间：2020-10-17 20:47

　　 转录因子c-Myb是造血过程中非常重要的调节因子,在细胞的增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要的作用。c-myb在造血祖细胞中表达量很高,随着细胞的分化,它的表达量会降低甚至会不表达。近期关于c-myb的异常表达会引发各种癌症,如白血病,乳腺癌,结肠癌的报道引起了人们的高度重视。尽管有很多报道阐述了关于c-myb表达调控机制的研究,但是由于c-myb缺乏典型的启动子并且有多种因子参与其中,因此了解c-myb的详细转录机制仍有很多疑问有待解决。有多项研究证明远端调控元件在c-myb表达调控中具有非常重要的作用,但是其详细的调控机制尚不明了。实验室前期数据表明,在小鼠骨髓白血病M1细胞中,c-myb的启动子上游25kb、50kb、70kb三个区域存在DNA调控元件与c-myb的启动子有互作,通过DNA-loop空间结构靠近c-myb基因启动子区,激活基因的表达并且诱发肿瘤的发生,同时发现转录因子Hoxa9、PU.1等可以通过结合这些远端元件来调控c-myb的转录,这一发现为研究白血病提供了新的思路,因此我们想进一步了解在人类白血病中是否有类似的远距离调控元件以及这些调控元件是如何调控c-myb的转录。随后我们在人的白血病细胞系K562中,使用环状染色体构象捕获(4C)的方法,以人类6号染色体c-myb基因的启动子为诱饵,发现了上游34k、88k两个与promoter启动子互作强的位点,证实了这两个上游远端调控元件可能会调控c-myb基因的表达。双荧光报告系统分析结果进一步表明了-34k、-88k的增强子活性,并且我们在这些区域发现了表观修饰H3K27ac的富集以及转录因子GATA1,TAL1的结合,因此我们猜测这些转录因子可能会参与c-myb的转录调控。基于以上的研究基础,我们想进一步了解这些远端调控元件以及表观修饰和转录因子是如何调控c-myb基因的。在本研究中,我们继续以人类红白血病细胞系K562为模型,研究位于人类6号染色体上的c-myb基因-34k、-88k的表观修饰以及转录因子对基因转录调控的影响,我们用铁血红素(hemin)诱导K562细胞分化后通过染色质免疫共沉淀(Ch IP-q PCR)的方法检测-34k、-88k区域的组蛋白H3K27ac以及转录因子GATA1、TAL1的富集情况,同时我们构建了靶向c-myb上游34k、88k的g RNA,利用CRISPR/Cas9系统携带相应的表观修饰酶类对远距离调控区域进行表观修饰,检测激活和抑制性表观修饰对c-myb表达的影响,最后我们将dCas9-p300和增强子g RNA共转染到K562细胞中,监测hemin诱导细胞分化后c-myb的表达情况,结果如下:1)铁血红素(hemin)诱导K562细胞分化24小时后,c-myb基因远端调控区域-34k、-88k的组蛋白修饰H3K27ac富集度降低,转录因子GATA1、TAL1的富集度也降低2)成功构建了靶向人类红白血病细胞系K562第6号染色体上c-myb基因promoter,-34k,-88k,-53k的g RNA(promoter为阳性对照,-53k为阴性对照),生工测序结果表明所有的g RNA已经成功克隆到p SPg RNA空载体质粒上,没有突变。3)ChIP-qPCR结果显示,dCas9-p300可成功靶标到-34k、-88k区域且增加这些区域的H3K27ac水平。4)dCas9-p300靶向c-myb基因-34k区域后提高了该区域的H3K27ac并且结合转录因子GATA1、TAL1激活c-myb基因的表达;dCas9-p300靶向c-myb基因-88k区域后提高了该区域H3K27ac并且结合转录因子GATA1激活c-myb基因的表达。5)ChIP-qPCR结果显示,dCas9-DNMT3A可成功靶标到-34k区域且增加该区域的DNA甲基化水平。6)dCas9-DNMT3A靶向c-myb基因-34k区域后提高了DNA甲基化水平抑制了cmyb基因的表达7)dCas9-p300靶向远端增强子后可以在一定程度上降低k562细胞分化以上所有的结果表明,在人类红系白血病K562中,hemin诱导细胞分化后,组蛋白H3K27ac和转录因子GATA1、TAL1等的富集度降低。在c-myb基因上游存在远距离调控元件-34k区域作为一个增强子,当乙酰转移酶dCas9-p300靶向该区域增加组蛋白H3K27ac后,结合转录因子GATA1、TAL1激活c-myb基因的表达,而甲基转移酶dCas9-DNMT3A靶向该区域增加DNA甲基化后可抑制c-myb基因的表达。-88k区域作为一个增强子,乙酰转移酶dCas9-p300靶向该区域增加组蛋白H3K27ac后,结合转录因子GATA1激活c-myb基因的表达。本次研究证明了这些远距离调控元件表观修饰后可以影响c-myb基因的表达,同时dCas9-p300靶向远端增强子后可以在一定程度上降低k562细胞分化,因此这些调控位点可以作为一个药物靶标,为进一步研究白血病提供一个新的突破点。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R346
【部分图文】：

1c-myb的结构

区域的增强子形成了一个包含Myb启动子和第一个内含子的活性染色质中心(ACH),结合了CTCF，GATA1/TAL1/LDB1等转录因子，随着红细胞分化后ACH不稳定，Myb表达下调[39]（图1.1.3.2）。图1.1.3.2 MYB在红系细胞分化模型中的动态转录调控模型[39]Figure 1.1.3.2 Dynamic transcriptional regulation model of MYB in erythroid cell differentiation

上海海洋大学硕士学位论文4图1.1.3.1：逆转录病毒整合区域与肿瘤细胞中c-myb的5末端长区域相互作用的模型[37]Figure 1.1.3.1:A model for interaction between the retroviral integrationregion and the 5-terminal long region of c-myb in tumor cells1.1.3.2 c-myb 与转录因子c-Myb的转录因子在造血祖细胞中均会表达的，在造血系统中也发挥着重要的作用[17]。近期相关研究显示，一些造血转录因子TF可与HBS1L-Myb基因间区的增强因子结合，进一步来控制着基因的表达[37]。有研究表明，红细胞发育受一系列TF控制，包括GATA1，LDB1，TAL1
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本文编号：2845301