脐带血造血干细胞的分离与贮藏工艺过程研究

发布时间：2020-10-18 00:53

　　 造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSC)在组织内并不是固定的细胞成员,而是作为一群原始的造血细胞被造血组织所包含,同时也能在造血组织及血液中生存。在生长到第二周的人类胚胎的卵黄囊内,造血干细胞就出现了,当人类胚胎发育到第四周的时候,造血干细胞开始在胎肝中出现。当孕妇怀孕达到五个月时,幼体骨髓中的造血功能开始运转,在人类出生后,骨髓就成为了造血干细胞存在的主要场所和主要来源地。根据造血干细胞来源地不同可将造血干细胞移植分为骨髓造血干细胞移植,脐血造血干细胞移植和外周血造血干细胞移植三个组别。没有供者限制这一点就是使用自体脐带血造血干细胞移植的最大优点,并且在移植过后,发生移植物抗宿主病的几率非常小,免疫抑制剂的使用量也大幅减少,几乎没有出现严重并发症,并且费用较低,因此很多用户都选择去储存自体脐带血。本文主要通过实验来研究造血干细胞在提取储存过程中的各种影响因素。第一部分研究了脐带血采集量和分离到的单个核细胞数之间的关系。通过6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),统计结果显示,脐带血采集量与分离收集的MNC数量之间线性相关,r=0.985,P0.0001。因此,在不对母婴造成影响的前提下,尽量多的采集脐带血可以增加收集分离的有MNC数量,进而满足移植的需要。第二部分主要研究脐带血不同分离方法对造血干细胞分离效果的影响,本部分首先分析了Ficoll分层法、6%羟乙基淀粉密度梯度离心法和6%羟乙基淀粉自然沉降法三种方法分离脐带血造血干细胞的效果,结果显示,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离得到的MNC数量最多,6%羟乙基淀粉自然沉降法次之,Ficoll分层法最低。对分离得到的MNC进行半固体琼脂培养,统计的CFU-GM集落数据显示6%羟乙基淀粉密度梯度离心法要明显高于其它两种方法。同时,本部分还对获得的MNC中细胞表型进行对比,与其他两种方法相比,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法会分离得到更多的CD3~+、CD14~+和CD34~+细胞。综合上述实验结果可知,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法是相对理想的脐带血造血干细胞分离方法。根据文献报道,多种因素会对6%羟乙基淀粉密度梯度离心法的分离效果造成影响。本研究利用响应面法对离心温度,离心力,离心时间三个影响因素进行了分析优化,最终得到在离心温度15℃、离心力1000g及离心时间17.8min时分离效果最佳,此时分离的细胞活力可达到95.7%。第三部分主要研究不同的冻存方法对造血干细胞冻存质量的影响。脐带血造血干细胞低温保存是脐带血库建设和临床移植成功的前提条件。目前,慢速分步冷却法是脐带血干细胞保存的主流方法。在该方法中,降温过程不同对复苏后细胞活力影响很大。本研究选取降温速率,降温时间及降温的终点温度作为三因素探究最佳的降温过程,响应面法结果显示,在降温速率为1.5℃/min、降温时间40h、降温终点温度为-80℃条件下,细胞复苏后活力可达到98.7%。由于快速降温,不产生冰晶和对细胞损伤小,玻璃化法在脐带血造血干细胞的长期保存方面展现出良好的应用前景。本论文对玻璃化法进行了初步的研究。根据文献报道,抗冻剂的种类和添加量,抗冻剂滴加速度以及滴加时的温度都会对玻璃化法冻存的细胞活性产生影响。本实验对抗冻剂人血清白蛋白添加浓度,滴加速度和滴加温度进行了优化,结果显示,在人血清白蛋白终浓度为17.1%、滴加温度为-8.32℃、滴加速度为2.84%/min条件下进行造血干细胞玻璃化冻存,最终细胞复苏活力为99.1%。
【学位单位】：河北科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

子之间的关系与液态相比无明显改变，因此可以避免该技术又被称为无冰晶技术。目前，脐带血造血干细方法。众所周知，慢速冻存过程中，冰晶对细胞的损存时细胞的质量和数量，同时，慢速降温所需要的程，最终增加了脐带血保存的费用和脐带血库的建设。超低温保存方法，可以有效地克服慢速冻存法的缺点，优点，对细胞活性的保存具有较好的效果，在脐带血现良好的应用前景[40,41]。核形成和生长而结冰。但是如果由于某种原因未形成快而使晶核没有足够时间生长，就会出现溶液低于冰度叫过冷点（Th）。另一方面，如果溶液降温速度足会形成，此时溶液就会进入无定形的玻璃态，这是一时的温度叫玻璃化形成温度（Tg）。玻璃化转变是一理论上，只要降温速度足够快，任何液体都可以进入使降温速度达到 107℃/s，但是这实际上不可能实现。问

第 2 章 脐带血采集量与单个核细胞数的关系19图2-1 脐带血冻存程序降温报告示意图2.2 结果本次实验共采集婴儿脐带血 3436 人份，血量（93±22）ml 即（45~198）ml 不等，

根据统计结果，利用 GraphPad Prism 软件作图（见图 3-2），可以看出脐带血采集量与分离收集的 MNC 数之间存在明显的线性关系。图2-2 脐带血采集量与提取的MNC数之间的关系2.3 本章小结本实验采用 6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离 MNC 是本人十几年工作的经验积累，后面章节会有详细论述。有文献对 53 份脐带血制备干细胞后进行结果统计，发现提取的单个核细胞含量随脐带血量增加而升高，两者之间呈正相关（r = 0.82）[45]。本部分同样对脐带血采集量与 MNC 之间的关系进行了分析。通过 6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离 MNC，统计结果显示，脐带血采集量与分离收集的 MNC 数量之间线性相关，r = 0.985，P< 0.0001。与文献报道的结果一致。因此，在不对母婴造成影响的前提下
【参考文献】

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1 黄望香;旷文勇;李睿娟;;脐带血血清培养脐带血间充质干细胞对脐带血CD34~+细胞的体外扩增作用[J];广东医学;2012年07期

2 党建红;金志军;;脐血干细胞的生物学特性及其应用[J];国际妇产科学杂志;2011年02期

3 黄璐;吴云;宋瑰琦;;深低温冻存脐血复苏后输注临床移植相关护理的研究进展[J];国际输血及血液学杂志;2011年02期

4 吴德沛;王秀丽;;T细胞调控与异基因造血干细胞移植[J];内科理论与实践;2010年01期

5 白旭华;;造血干细胞的表面标志和临床应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年15期

6 李洁羽;叶韵斌;陈淑萍;陈明水;周智锋;;三种标记法对脐血CD_(34)~+造血干细胞绝对计数的比较分析[J];中华检验医学杂志;2007年03期

7 赖永榕;造血干细胞移植的临床应用进展[J];广西医学;2005年10期

8 张学忠,徐燕丽;脐血血浆的研究及应用[J];临床血液学杂志;2003年01期

9 奚永志,唐佩弦;深入开展脐血干细胞的基础与临床研究[J];中华血液学杂志;1999年08期

10 奚永志,李秀森,张双喜,唐佩弦,毛宁,魏文,孔繁华;人正常骨髓 CD_(34)~+ 造血细胞的形态学与细胞化学特征[J];中华血液学杂志;1997年03期

本文编号：2845545